Inmunofenotipado de subpoblaciones de linfocitos
La identificación celular se basa en la detección de antígenos marcadores específicos utilizando anticuerpos marcados con fluorocromos.
- Linfocitos T: el recuento de la población total se realiza mediante anticuerpos monoclonales frente a CD3, el marcador absoluto de las células T. Las subpoblaciones CD4+ y CD8+ se detectan simultáneamente con CD3 utilizando fluorocromos con emisión de contraste (verde, anaranjado, rosa), ya que estos receptores también pueden expresarse en otras células.
- Linfocitos B: se identifican mediante anticuerpos frente a CD19 (presente en todas las células B). Para evaluar la monoclonalidad en procesos linfoproliferativos, se estudian adicionalmente las cadenas $\kappa$ y $\lambda$ de membrana.
Evaluación de la actividad proliferativa y del ciclo celular
La capacidad funcional de los linfocitos T se evalúa por su respuesta proliferativa policlonal a los mitógenos. En la práctica moderna, se utilizan anticuerpos monoclonales frente a CD3 (acoplados a plástico) en combinación con anticuerpos solubles frente a la molécula costimuladora CD28 para la estimulación.
Para medir la proliferación y los parámetros del ciclo celular se emplean los siguientes enfoques:
- Citometría de flujo con marcaje CFSE: el colorante éster succinimidílico de carboxifluoresceína se une a las proteínas intracelulares y se distribuye uniformemente entre las estructuras hijas durante la mitosis. En el citograma, el pico situado más a la derecha corresponde a las células no divididas, mientras que los picos desplazados de derecha a izquierda reflejan poblaciones que han sufrido 1, 2, 3 o más divisiones.
- Método radioisotópico: la medición de la incorporación de $^3$H-timidina sirve como patrón de referencia en cuanto a sensibilidad, aunque conlleva las desventajas del uso de radionúclidos.
- Evaluación del ciclo celular: la tinción con yoduro de propidio mediante un software especializado permite calcular la proporción de células con contenido de ADN hiperdiploide en las fases G1+S, G2 y en mitosis.
Diagnóstico de laboratorio de la apoptosis
El análisis de la muerte celular programada de los linfocitos se realiza mediante dos métodos citofluorimétricos:
- Tinción con yoduro de propidio: durante la apoptosis se pierde parte del material nuclear, por lo que las células moribundas forman un pico hipodiploide característico que en el histograma se sitúa a la izquierda del pico diploide.
- Unión a anexina V: la anexina V marcada se une selectivamente a la fosfatidilserina, que se transloca a la superficie externa de la membrana celular exclusivamente durante la apoptosis.
Análisis funcional de linfocitos T colaboradores (Th1 y Th2) y ELISPOT
La evaluación de la capacidad de los linfocitos T colaboradores para producir citocinas requiere tinción intracelular e incluye las siguientes etapas sucesivas:
- Activación: las células se estimulan con una combinación de acetato de miristato de forbol (activador de la proteína cinasa C) y ionomicina (ionóforo de calcio) sin pasar por los receptores antigénicos.
- Bloqueo de la secreción: el colorante brefeldina A altera el transporte intracelular en el aparato de Golgi, reteniendo las citocinas en el interior.
- Permeabilización y tinción: la membrana se trata con saponina, tras lo cual se introducen anticuerpos contra las citocinas. El marcador clave para Th1 es IFNγ, y para Th2 es IL-4.
Para el recuento cuantitativo de las células secretoras de citocinas (principalmente productoras de IFNγ Th1) también se utiliza el método ELISPOT (Enzyme-linked immunospot). En este ensayo, las células se incuban sobre una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos, fijando la citocina liberada mediante un inmunoensayo enzimático.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿En qué células del sistema inmunitario, además de los linfocitos T, pueden expresarse los receptores CD4 y CD8?
Además de los linfocitos T, los receptores CD4 y CD8 pueden expresarse en macrófagos y células dendríticas.
- CD4: está presente en pequeña cantidad en algunos macrófagos, lo que los hace susceptibles a la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.
- CD8: se utiliza para analizar subpoblaciones en ratones y marca una parte significativa de las células dendríticas linfoides.
¿En qué consiste el principio de visualización y recuento cuantitativo de las células secretoras en el método ELISPOT?
El principio de visualización y recuento en el método ELISPOT se basa en la detección inmunoenzimática de la citocina secretada localmente.
- Visualización: la citocina secretada por la célula se une a anticuerpos fijados en una membrana de nitrocelulosa. El complejo formado se detecta mediante anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa, lo que da lugar a la formación de manchas coloreadas.
- Recuento cuantitativo: se realiza contando las manchas coloreadas formadas mediante un microscopio o un dispositivo especial. Cada mancha corresponde a una célula que secreta la citocina estudiada.
¿Qué antígenos de diferenciación de superficie se utilizan como marcadores de activación temprana y tardía de los linfocitos T?
Como marcadores de activación de los linfocitos T se utilizan los siguientes antígenos de superficie:
- CD69: el antígeno de activación más temprano, que aparece en la superficie a las 2–3 horas.
- CD25: marcador de activación temprana que representa la cadena $\alpha$ del receptor de la interleucina-2 (aparece a las 4 horas).
- CD71: marcador de etapa intermedia, receptor de transferrina (se expresa a las 24 horas).
- MHC-II: marcadores de activación tardía de los linfocitos T, cuya expresión comienza entre los días 3 y 6.
Asimismo, en la etapa tardía (días 4–8) aparecen las moléculas de adhesión: integrinas $\beta_1$.
CD3: TODOS los linfocitos T; CD19: TODOS los linfocitos B; CFSE: cuenta las divisiones de derecha a izquierda; Anexina V: busca fosfatidilserina durante la apoptosis.
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué los marcadores CD4 y CD8 se detectan únicamente junto con CD3?
Las moléculas CD4 y CD8 pueden expresarse no solo en linfocitos T. Para identificar con precisión las subpoblaciones de linfocitos T, se tiñen simultáneamente con CD3 utilizando fluorocromos de contraste.
¿Cómo interpretar el gráfico de citometría al utilizar el colorante CFSE?
El pico situado más a la derecha con mayor intensidad de fluorescencia representa las células no divididas. Cada pico sucesivo hacia la izquierda corresponde a las células que han completado 1, 2, 3 o más ciclos de división.
¿Por qué se emplean brefeldina A y saponina durante el análisis de citocinas?
La brefeldina A bloquea el transporte de sustancias a través del aparato de Golgi y previene la secreción al exterior de las citocinas. La saponina permeabiliza la membrana, permitiendo que los anticuerpos penetren en el interior de la célula.
Qué más repasar sobre el tema
- Uso de cadenas kappa y lambda de membrana para evaluar la monoclonalidad de los linfocitos B
- Análisis comparativo del método radioisotópico ($^3$H-timidina) y el marcador CFSE
- Evaluación de la reactividad de los clones celulares en la prueba de inhibición de la migración de leucocitos
- Algoritmo detallado para la realización y detección de resultados del método ELISPOT
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