Variante competitiva de ELISA
Este tipo de ensayo se aplica cuando el objetivo principal es la detección de anticuerpos contra antígenos previamente conocidos.
El mecanismo se basa en el principio de competencia directa. En la fase sólida (plástico) se sorbe un antígeno. Dos tipos de anticuerpos compiten por unirse a él: los buscados (del suero del paciente, que no tienen marcador) y los anticuerpos marcados añadidos especialmente.
La evaluación de los resultados aquí tiene una relación inversa: la medida de la concentración de anticuerpos del paciente es el grado de inhibición de la unión de los reactivos marcados. Cuantos más anticuerpos propios haya en la muestra, menos marcadores enzimáticos podrán unirse al antígeno en comparación con la muestra de control (donde los competidores están ausentes). Para la visualización de la reacción se utilizan sustratos cromógenos que reaccionan con la enzima (normalmente peroxidasa o fosfatasa alcalina).
Variante de sitio dual (método de sándwich)
Este formato se utiliza para buscar el antígeno. Un requisito indispensable para realizar el ensayo de sándwich es que la molécula del antígeno diana posea al menos dos epítopos (sitios de unión) diferentes.
Etapas del procedimiento:
- En la superficie del pocillo de plástico se fijan rígidamente anticuerpos específicos para el primer epítopo del antígeno diana.
- Se añade la muestra de estudio con el antígeno, produciéndose la unión primaria.
- En la parte superior se colocan «segundos anticuerpos» que reconocen el segundo epítopo del mismo antígeno.
Para registrar los resultados en la variante clásica se utilizan anticuerpos antiisotípicos portadores de un marcador enzimático. Sin embargo, existe una modificación más moderna que mejora la estandarización y la sensibilidad. En ella, los «segundos anticuerpos» se marcan previamente con estreptavidina, y la detección se realiza mediante biotina, que ya está conjugada con la enzima. La concentración final del antígeno en la muestra es directamente proporcional a la cantidad de marcador unido.
Métodos relacionados: citometría de flujo
Además del ELISA, la citometría de flujo se utiliza activamente para analizar células inmunitarias. El método se lleva a cabo en un citómetro de flujo láser: las células se alinean en una sola fila y pasan a través de un capilar muy fino bajo un rayo láser.
El dispositivo registra automáticamente los parámetros de dispersión de la luz:
- Dispersión frontal de la luz (FSC) — permite evaluar el tamaño físico de la célula que pasa.
- Dispersión lateral de la luz (SSC) — proporciona información sobre la estructura interna, en particular sobre la granularidad.
Sobre la base de estos datos se construye una distribución bidimensional que permite aislar poblaciones celulares específicas. Para un análisis más profundo se aplica tinción fluorescente. Utilizando anticuerpos monoclonales marcados con fluoróforos, es posible detectar moléculas marcadoras en la membrana o dentro de la célula. Los aparatos modernos están equipados con varios láseres y son capaces de distinguir más de 10 colores simultáneamente. El mismo principio es la base del fraccionamiento (clasificación) celular según la expresión de las moléculas deseadas.
Métodos de biología molecular
Para la detección de factores de importancia inmunológica en el diagnóstico, las herramientas de biología molecular se utilizan cada vez más. El líder absoluto en este campo ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que complementa las pruebas inmunoquímicas clásicas.
Para recordar la esencia del método de sándwich, imagine un sándwich: el trozo de pan inferior son los anticuerpos fijos contra el 1.er epítopo, el trozo superior son los anticuerpos contra el 2.º epítopo, y la hamburguesa del medio es el propio antígeno buscado.
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué en el ELISA competitivo la señal es menor si hay más anticuerpos?
Porque los anticuerpos no marcados del suero del paciente ocupan los lugares en el antígeno, impidiendo que los anticuerpos marcados del sistema de prueba se unan. La concentración se evalúa precisamente según el grado de inhibición de la unión del marcador.
¿Para qué se necesitan la estreptavidina y la biotina en el ELISA?
Es un sistema moderno de registro de resultados en el método de sándwich. El uso de estreptavidina en los «segundos anticuerpos» y biotina con enzima permite aumentar significativamente la sensibilidad del ensayo.
¿Qué muestran los parámetros básicos en la citometría de flujo?
Los parámetros básicos se basan en la dispersión de la luz. La dispersión frontal del rayo láser refleja el tamaño de la célula, y la lateral, su granularidad.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismo de la reacción de los sustratos cromógenos con la peroxidasa
- Principios del fraccionamiento y clasificación láser de células
- Uso de anticuerpos monoclonales en el análisis fluorescente
- Reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en el inmunodiagnóstico
- Análisis de gráficos de distribución bidimensional en citometría de flujo
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