Cómo se crean los hibridomas
El proceso de obtención de hibridomas consta de varios pasos clave:
- Inmunización: Se inmuniza a un ratón de laboratorio con el antígeno deseado.
- Extracción de células: Se extraen células Productoras de anticuerpos (esplenocitos) del bazo del animal.
- Hibridación: Los esplenocitos se fusionan con células de mieloma especiales. El requisito principal para la línea de mieloma es que no debe producir sus propias inmunoglobulinas. Como resultado, se forma un heterocarion (una célula con dos núcleos) y luego una sola célula híbrida.
- Selección en medio HAT: La mezcla celular obtenida se coloca en un medio selectivo para eliminar las células no fusionadas.
- Clonación: Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada se seleccionan y multiplican. La clonalidad se confirma mediante isoelectroenfoque.
El principio de selección en medio HAT
El medio HAT contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un tóxico que bloquea la vía principal de síntesis de nucleótidos en la célula.
En este medio solo sobreviven los hibridomas, ya que combinan las propiedades de ambas células parentales:
- Las células de mieloma no fusionadas mueren. Su vía principal está bloqueada por la aminopterina y las enzimas para la vía de rescate son defectuosas genéticamente.
- Los esplenocitos no fusionados mueren por sí mismos, ya que no son capaces de vivir mucho tiempo in vitro.
- Los hibridomas sobreviven. Del mieloma heredan la «inmortalidad» y de la célula normal, los genes funcionales para la vía de rescate de la síntesis de nucleótidos utilizando hipoxantina y timidina.
Humanización de anticuerpos
Dado que resultó difícil crear hibridomas a partir de células humanas y la demanda de anticuerpos monoclonales humanos con fines terapéuticos es alta, se emplea la ingeniería genética.
El proceso de «humanización» incluye la sustitución de las regiones estructurales de los genes de ratón por genes humanos. Como resultado, del anticuerpo de ratón solo quedan las regiones hipervariables responsables de la unión al antígeno, y la molécula pierde su antigenicidad para el sistema inmunitario humano.
Presentación en fagos y anticuerpos mínimos
La tecnología de presentación en fagos (phage display) permite crear moléculas de unión a antígenos sin utilizar animales:
- A partir de los genes de los linfocitos B, se forma una genoteca combinatoria de moléculas Fab.
- Los genes se fusionan con el gen de una proteína de la cápside del bacteriófago.
- Mediante el uso de un antígeno, se seleccionan los fagos con la especificidad deseada, los cuales posteriormente se multiplican en bacterias.
De esta manera se obtienen moléculas mínimas de unión a antígenos: scFv (dominios V de las cadenas H y L unidos covalentemente) y mini-anticuerpos. Son útiles para la creación de conjugados con fármacos, toxinas o fluoróforos.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué etapas comprende la tecnología de presentación en fagos?
La tecnología de presentación en fagos consta de seis etapas para la creación y selección de moléculas de unión a antígenos con la especificidad deseada.
- Aislamiento de genes — a partir de genotecas de genes expresados de linfocitos B, se aíslan los genes V de las cadenas H y L.
- Creación de la genoteca combinatoria — los genes se combinan en asociaciones aleatorias, obteniendo un conjunto de moléculas Fab de diversa especificidad.
- Fusión de genes — los genes de las moléculas Fab se fusionan con los genes de la proteína filamentosa de la cápside del bacteriófago pIII.
- Amplificación de fagos — los fagos se replican en bacterias, formando una genoteca de presentación en fagos.
- Selección — mediante un antígeno inmovilizado, se recuperan los fagos que codifican los dominios Fab con la especificidad deseada.
- Infección — con los fagos seleccionados se infectan células bacterianas, las cuales se convierten en fábricas para la producción de las moléculas requeridas.
Preguntas de clases y exámenes
¿Para qué sirve el medio HAT?
El medio HAT permite eliminar las células tumorales no fusionadas (al bloquear las vías de síntesis de nucleótidos), dejando vivos únicamente a los hibridomas, los cuales obtienen las enzimas para la vía alternativa de rescate a partir del linfocito normal.
¿En qué consiste la humanización de los anticuerpos de ratón?
La humanización es la sustitución por ingeniería genética de las regiones estructurales de un anticuerpo de ratón por sus equivalentes humanos. Del ratón solo se conservan las regiones que reconocen el antígeno, evitando así que el anticuerpo desencadene una respuesta inmunitaria en el ser humano.
¿Qué es el scFv?
Es una molécula mínima de unión a antígeno (una cadena única compuesta por los dominios V de las cadenas pesada y ligera), generada mediante la tecnología de presentación en fagos.
Qué más repasar sobre el tema
- Métodos de cribado de anticuerpos (ELISA, citometría de flujo)
- Criterios de selección de clones de hibridomas
- Características del almacenamiento y producción a gran escala de anticuerpos monoclonales
- Aplicación práctica de los anticuerpos mínimos en la terapia dirigida
- Memoria inmunológica y respuesta secundaria
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