Métodos de obtención de genes
Para crear una molécula recombinante, primero es necesario obtener el fragmento de interés en cantidad suficiente. Esto se puede lograr de dos maneras principales:
- Transcripción inversa. Se emplean enzimas de retrovirus: las transriptasas inversas. Son capaces de catalizar la síntesis de una molécula de ADN utilizando ARNm como molde.
- Síntesis química. Se utilizan sintetizadores automáticos que crean ADN monocatenario con una secuencia predeterminada. La principal limitación de este método es que la longitud del fragmento no debe superar los 100 nucleótidos.
Papel de las restrictasas
Las restrictasas (endonucleasas) son enzimas de origen bacteriano que actúan como «tijeras» moleculares. Su función principal es reconocer secuencias cortas y específicas de nucleótidos (sitios de restricción) y escindir ambas hebras de ADN en dichos puntos.
Existen cientos de variedades de restrictasas, cada una específica para un sitio determinado. Al realizar el corte, se pueden formar dos tipos de extremos:
- Extremos «romos»: la enzima corta ambas cadenas exactamente una frente a la otra.
- Extremos «pegajosos»: el corte se produce con un desfase. Como resultado, se forman regiones monocatenarias capaces de unirse a otros fragmentos por complementariedad de bases.
Etapas de creación del ADN recombinante
La síntesis de una molécula híbrida se basa en el uso de restrictasas que generan extremos «pegajosos» (por ejemplo, Eco RI). El proceso comprende los siguientes pasos:
- Preparación. El gen diana y el ADN vector (por ejemplo, un plásmido bacteriano o ADN viral) se cortan con la misma restrictaza. Esto es necesario para generar extremos «pegajosos» idénticos y complementarios en ambas moléculas.
- Hibridación (apareamiento). Las colas monocatenarias de diferentes fragmentos se aparean entre sí gracias a la complementariedad de las bases nitrogenadas.
- Ligación. La enzima ADN ligasa une covalentemente los fragmentos, restaurando por completo el esqueleto fosfodiester. El resultado final es un ADN recombinante listo.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué moléculas se utilizan como vectores para la creación de ADN recombinante?
Como vectores para la creación de ADN recombinante se utilizan las siguientes moléculas:
- Plásmidos: ADN circular extracromosómico bacteriano.
- ADN de bacteriófagos o virus.
Los vectores son necesarios para introducir el gen extraño en la bacteria y garantizar la replicación, transcripción y traducción del gen introducido.
Además de la transcripción inversa y la síntesis química, ¿qué otros métodos se emplean para obtener los genes diana?
Además de la transcripción inversa y la síntesis química, para obtener los genes diana se emplean métodos de aislamiento (clonación) de genes naturales:
- Aislamiento de estructuras genéticas completas (cromosomas, plásmidos).
- Excisión enzimática: uso de restrictasas que cortan el ADN en enlaces específicos.
- Ruptura de ARN: uso de ribozimas que actúan sobre el ARN de manera similar a las restrictasas.
Para recordar los tipos de extremos en la restricción: el «romo» corta derecho (sin salientes) y el «pegajoso» con desplazamiento, dejando una cola para «pegarse» al vecino.
Preguntas de clases y exámenes
¿Qué enzimas sintetizan ADN a partir de un molde de ARNm?
Esta reacción es catalizada por las transcriptasas inversas (enzimas de retrovirus).
¿En qué se diferencian los extremos «romos» de los «pegajosos»?
En la formación de extremos «romos», las cadenas de ADN se cortan exactamente una frente a la otra, mientras que en la formación de extremos «pegajosos» se cortan con un desfase, lo que genera colas monocatenarias complementarias.
¿Qué enzima une los fragmentos de ADN?
La unión covalente de los fragmentos y la restauración del esqueleto fosfodiester son llevadas a cabo por la ADN ligasa.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismo de acción de la enzima Eco RI
- El proceso de clonación molecular en células bacterianas
- Especificidad de los sitios de restricción
- Sistemas vectoriales: plásmidos, bacteriófagos, virus
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