Vectores y preparación de genes
Para transferir material genético extraño a una bacteria se requieren moléculas transportadoras especiales: los vectores. Con mayor frecuencia, estos desempeñan el papel de bacteriófagos o plásmidos (moléculas de ADN extracromosómico circular bacteriano).
El proceso comienza con la preparación del vector y el fragmento de ADN donante que contiene el gen de interés. Ambas moléculas se tratan con la misma enzima: una enzima de restricción. Esto es necesario para cortar el plásmido circular en un sitio de restricción específico y obtener un fragmento lineal de ADN donante con extremos idénticos complementarios («pegajosos») listos para la unión.
Etapas principales de la clonación
El procedimiento de creación e introducción de la molécula recombinante comprende varios pasos secuenciales estrictos:
- Ligación. El plásmido linearizado preparado previamente y el fragmento de ADN extraño se unen. Como resultado, se forma un plásmido quimérico (ADN recombinante) que combina el material genético del vector y el inserto.
- Transformación. La molécula quimérica se introduce en la célula hospedadora (bacteria). Ahora, dentro de la célula bacteriana se encuentra no solo su propio cromosoma (nucleoide), sino también el nuevo plásmido introducido.
- Selección (tamizado). Es necesario identificar y seleccionar únicamente aquellas bacterias que han capturado con éxito el ADN recombinante. Para ello, se utilizan genes de resistencia a antibióticos contenidos inicialmente en el plásmido.
- Cultivo. Las bacterias seleccionadas supervivientes se multiplican activamente en un medio nutritivo. Durante la división celular, se produce la replicación de los plásmidos, es decir, la clonación directa del fragmento de ADN insertado.
Dos orientaciones para el uso de células
Tras el crecimiento exitoso del cultivo bacteriano, las acciones posteriores se dividen en dos direcciones según el objetivo final del experimento:
- Amplificación (obtención de ADN). Si el investigador necesita el gen clonado en sí, los plásmidos recombinantes se aíslan de la biomasa bacteriana acumulada. A continuación, se vuelven a tratar con la misma enzima de restricción para escindir el inserto y se purifica el fragmento de interés. El resultado es la obtención de un gran número de copias de la molécula de ADN requerida.
- Expresión (obtención de proteínas). Si se requiere el producto del gen, el crecimiento del cultivo bacteriano se lleva a cabo en condiciones específicas que estimulan la transcripción y traducción del gen clonado. Las células producen activamente la proteína de interés, tras lo cual se lisan y el producto proteico resultante se purifica minuciosamente.
Aplicación práctica de la tecnología
El mecanismo de utilización del ADN recombinante revolucionó la medicina, la biología y la farmacología. Las principales áreas de aplicación incluyen:
- Uso de microorganismos como productores. Las bacterias sintetizan sustancias vitales para el ser humano: hormonas proteicas (insulina, hormona del crecimiento, somatostatina), péptidos biológicamente activos, vacunas (por ejemplo, contra la hepatitis C) y factores de coagulación sanguínea (factor VIII para el tratamiento de la hemofilia).
- Terapia génica. Tratamiento de enfermedades hereditarias graves mediante la introducción de copias normales de genes defectuosos en el organismo.
- Mejora genética. Creación de formas genéticas de plantas y animales fundamentalmente nuevas con propiedades útiles predeterminadas.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué enzima realiza la unión del plásmido y el fragmento de ADN extraño en la etapa de ligación?
La unión del plásmido y el fragmento de ADN extraño es realizada por la enzima ADN ligasa. Esta enzima une covalentemente los fragmentos mediante la restauración de los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes.
Como resultado de este proceso, se restablece la integridad del esqueleto azúcar-fosfato de la molécula y se forma el ADN recombinante (híbrido). Se distinguen los siguientes métodos de unión de fragmentos:
- Por extremos «pegajosos» mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre regiones monocatenarias de nucleótidos complementarios.
- Mediante extremos «pegajosos» construidos artificialmente.
- Por extremos «romos».
¿Qué tipos de enzimas de restricción existen y se emplean en ingeniería genética?
En ingeniería genética se utilizan alrededor de 200 enzimas de restricción (endonucleasas de restricción), las cuales se clasifican según el tipo de corte que producen en la molécula de ADN.
| Tipo de corte | Mecanismo | Resultado |
|---|---|---|
| A lo largo del eje de simetría | Corte a lo largo del eje de simetría de la secuencia reconocida | Se generan extremos «romos» de doble cadena |
| Con desplazamiento | Corte con desplazamiento, con formación de un «saliente» | Se generan extremos «pegajosos» con regiones mutuamente complementarias |
Los extremos «pegajosos» pueden formarse en el extremo 5' (fosfatos) o en el extremo 3' (hidroxilos).
Cómo recordar la secuencia básica de clonación: RLTSC (Restricción — Ligación — Transformación — Selección — Cultivo). «Rortan la linea — Tiran para sí las copias».
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué se debe tratar el plásmido y el ADN donante con la misma enzima de restricción?
Esto es necesario para crear extremos «pegajosos» idénticos. Solo en este caso el fragmento de ADN donante podrá integrarse perfectamente en el plásmido cortado según el principio de complementariedad.
¿Cómo separar las bacterias con el plásmido quimérico de las células que no lo poseen?
Mediante selección con antibióticos. El plásmido porta un gen de resistencia al fármaco. Al crecer en un medio con este antibiótico, solo sobreviven aquellas bacterias que han capturado con éxito el vector.
¿Cuál es la diferencia entre la amplificación y la expresión del gen clonado?
La amplificación está orientada a obtener múltiples copias de la molécula de ADN en sí. La expresión, en cambio, implica que la bacteria «leerá» el gen introducido y sintetizará la proteína de interés a partir de este.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismo de acción de las endonucleasas de restricción
- La enzima ADN ligasa y las bases moleculares de la ligación
- Métodos de transformación de células bacterianas
- Principios de inducción de la expresión génica en bacterias
- Métodos de lisis celular y purificación de proteínas recombinantes
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