Efecto citopatógeno (ECP) e inclusiones intracelulares
Una de las principales pruebas de la reproducción viral son los cambios visibles al microscopio en las células infectadas. La naturaleza del efecto citopatógeno es específica para diferentes grupos de virus, lo que permite su identificación orientativa.
Se distinguen las siguientes variantes de ECP:
- Destrucción: el daño más pronunciado. Incluye vacuolización citoplasmática, destrucción mitocondrial y redondeo celular. Como resultado, se desprenden del vidrio y mueren.
- Formación de sincitios: fusión de las membranas de células vecinas con la formación de estructuras gigantes multinucleadas.
- Proliferación: crecimiento exagerado temporal de la masa celular, que de todos modos termina posteriormente en destrucción.
Una manifestación peculiar del ECP es la formación de inclusiones intracelulares. Pueden ser acumulaciones de las propias partículas virales (viriones), de sus componentes individuales (proteínas o ácidos nucleicos) o material celular alterado reactivamente («cementerios celulares»).
Las inclusiones tienen tamaños de 0,2 a 25 µm, pueden ser redondeadas o de forma irregular, únicas o múltiples. Se detectan mediante microscopía óptica (con tinción de colorantes de anilina) o microscopía de luminiscencia (tinción con fluoróforos).
La localización de las inclusiones tiene valor diagnóstico:
- Citoplasmáticas: características del virus de la viruela humana (cuerpos de Guarnieri) y del virus de la rabia (cuerpos de Babes-Negri).
- Intranucleares: se observan en la infección por herpesvirus y adenovirus.
Método de «placas» (colonias negativas)
El método de placas se utiliza no solo para la indicación, sino también para la cuantificación y diferenciación de virus. Las «placas» son focos limitados de células destruidas en una monocapa. Visualmente, aparecen como manchas claras sobre un fondo continuo de células vivas teñidas.
Técnicamente, el método se implementa añadiendo agar al medio de cultivo sobre la monocapa celular. El agar actúa como una barrera física: limita la libre difusión del virus. Como resultado, la nueva generación de viriones infecta exclusivamente a las células vecinas.
El método se basa en el principio de clonación: cada placa se forma como resultado de la multiplicación de un virión original. Esto permite:
- Determinar la concentración: el recuento del número de colonias negativas permite calcular el título viral en el material.
- Diferenciar patógenos: los virus forman placas que se diferencian en los tiempos de aparición, forma y tamaño.
- Realizar selección: a partir de una sola placa se puede aislar la descendencia y obtener líneas puras (cepas) de virus.
Interacción con eritrocitos
Muchos virus poseen proteínas de superficie: hemaglutininas. Son capaces de interactuar con receptores en las membranas de eritrocitos humanos, de aves o de mamíferos. Dos métodos de indicación se basan en esta propiedad:
- Reacción de hemadsorción. Las células infectadas cambian las propiedades de su superficie y adquieren la capacidad de fijar (adsorber) eritrocitos directamente sobre su membrana celular. Esto es característico de los virus de la gripe y paragripe. El valor del método radica en que permite detectar el virus incluso cuando la destrucción celular (ECP) aún no se ha producido.
- Reacción de hemaglutinación (RHA). Un mecanismo similar, pero dirigido a detectar virus que ya han salido de las células en el líquido de cultivo. Las partículas virales aglutinan entre sí los eritrocitos añadidos.
Reacción «de color» (método de la prueba de color)
Este método permite registrar el hecho de la reproducción viral sin microscopía, orientándose por el cambio de pH del medio de cultivo. Al medio se le añade previamente un indicador especial.
Resultado negativo (no hay virus): Las células sanas metabolizan activamente los nutrientes. Durante su actividad vital, se liberan al medio productos metabólicos ácidos. Esto conduce a la acidificación del medio (disminución del pH), como resultado de lo cual cambia el color del indicador.
Resultado positivo (el virus se está multiplicando): La infección viral suprime el metabolismo celular normal y provoca la muerte celular. Como las células están muertas, no se liberan productos ácidos y el pH se mantiene en el nivel inicial. Como resultado, el medio de cultivo conserva el color inicial del indicador, lo que sirve como señal de una indicación viral exitosa.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué virus causan la formación de sincitios en un cultivo celular infectado?
La formación de sincitios (células gigantes multinucleadas) en un cultivo infectado es causada por paramixovirus: virus de la paragripe, paperas, sarampión y VRS. Los sincitios se forman debido a la actividad de la proteína de fusión F. En el sarampión, las células gigantes multinucleadas pueden estar representadas por las células de Warthin-Finkeldey.
¿Qué colorantes específicos se utilizan para revelar inclusiones virales en microscopía óptica?
Para revelar inclusiones virales en microscopía óptica se utilizan colorantes de anilina y una serie de métodos de tinción especiales.
- Tinción de Romanovsky-Giemsa: se utiliza para revelar inclusiones intranucleares de Cowdry (virus ADN) y cuerpos citoplasmáticos de Babes-Negri (virus de la rabia).
- Tinción con hematoxilina y eosina: se utiliza para detectar inclusiones virales intranucleares en citomegalocélulas (síntoma del «ojo de búho»).
- Tinciones de Mann, Turevich y Múromtsev: métodos específicos para visualizar los cuerpos de Babes-Negri en frotis de impronta o cortes de tejido cerebral.
Para memorizar los principales métodos de indicación, se puede utilizar la frase: «Color Placa Incluye Hemo-ECP» (Prueba de color, Placas, Inclusiones, Hemaglutinación/Hemadsorción, Efecto citopatógeno).
Preguntas de clases y exámenes
¿Cuál es la diferencia entre hemaglutinación y hemadsorción?
En la hemadsorción, los eritrocitos se adhieren a la superficie de las células de la monocapa infectadas por el virus. En la hemaglutinación, las partículas virales que flotan libremente en el líquido de cultivo aglutinan los eritrocitos entre sí.
¿Por qué la conservación del color en la «prueba de color» indica la presencia de virus?
El virus en reproducción mata las células deteniendo su metabolismo. Debido a esto, dejan de liberar productos metabólicos ácidos, el pH no baja y el color del indicador permanece inalterado.
¿Para qué se utiliza la cobertura de agar en el método de placas?
El agar bloquea la libre diseminación de las partículas virales por todo el medio líquido. Gracias a esto, la descendencia del virus solo puede infectar estrictamente a las células vecinas, formando un foco limitado de destrucción: una placa.
Qué más repasar sobre el tema
- Características de la aplicación de fluoróforos en la microscopía de luminiscencia de inclusiones
- Mecanismos de formación de sincitios celulares
- Especificidad de las hemaglutininas hacia eritrocitos de diferentes especies animales
- Técnica para obtener líneas puras de virus a partir de placas
- Diferencias entre inclusiones intranucleares de adenovirus y herpesvirus
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