Naturaleza de los enlaces químicos
El complejo antígeno-anticuerpo se mantiene unido mediante interacciones no covalentes. Para que estas fuerzas actúen, las moléculas deben acercarse a una distancia muy corta. Dicha aproximación solo es posible con un alto grado de correspondencia espacial (complementariedad) entre el centro activo del anticuerpo y el epítopo del antígeno.
En la formación del complejo participan cuatro tipos principales de fuerzas:
- Interacciones electrostáticas: atracción de grupos con cargas opuestas (por ejemplo, grupos amino y carboxilo ionizados). La fuerza de atracción disminuye en proporción inversa al cuadrado de la distancia.
- Enlaces de hidrógeno: se forman con la participación de átomos de hidrógeno y oxígeno.
- Interacciones hidrófobas: cohesión de regiones apolares de las moléculas en un medio acuoso.
- Fuerzas de van der Waals: débil atracción de nubes electrónicas fluctuantes. Requieren máxima proximidad, ya que su intensidad disminuye con gran rapidez (en proporción inversa a la séptima potencia de la distancia).
Afinidad y avidez: ¿cuál es la diferencia?
La unión del anticuerpo con el antígeno es reversible y obedece a las leyes de la termodinámica (en particular, a la ley de acción de masas). Para evaluar la fuerza de esta interacción se utilizan dos conceptos clave.
Afinidad: es la fuerza con la que el sitio activo de un anticuerpo retiene un epítopo específico. Para expresarla cuantitativamente se utiliza la constante de equilibrio (o constante de asociación, Ka). Cuanto mayor es, más fuerte es el complejo. A menudo también se emplea el valor inverso: la constante de disociación (Kd = 1/Ka). Es interesante destacar que, durante el desarrollo de la respuesta inmunitaria, el organismo es capaz de mejorar la calidad de las moléculas producidas; este proceso se denomina «maduración de la afinidad».
Avidez (afinidad funcional): es la fuerza de unión total entre un antígeno grande (que posee múltiples epítopos) y los anticuerpos. La avidez siempre es mayor que la simple suma de las afinidades individuales. Si se rompe la unión con un epítopo, las moléculas no se separarán, ya que serán retenidas por otros puntos de contacto.
Fenómeno de precipitación y teoría de red
Antes de la aparición de las pruebas de alta precisión modernas, la interacción entre antígenos y anticuerpos se estudiaba a través de sus manifestaciones secundarias visibles. Uno de estos fenómenos es la precipitación, es decir, la sedimentación del complejo inmune.
Las leyes de este proceso se describen mediante la teoría de la red:
- Los anticuerpos son bivalentes (poseen dos centros de unión) y los antígenos son multivalentes.
- En solución, las moléculas de anticuerpo comienzan a actuar como puentes, «entrelazando» diferentes moléculas de antígeno entre sí.
- Gradualmente se forma una «red» molecular tridimensional gigante que pierde su solubilidad.
La cantidad máxima de precipitado se forma únicamente en la zona de equivalencia, con un balance de concentración ideal, cuando no quedan reactivos libres en solución.
- Si hay un exceso de antígeno en el medio, solo se forman pequeños complejos dispersos.
- Si surge un exceso de anticuerpos (fenómeno de «bloqueo»), las moléculas de antígeno quedan completamente cubiertas por anticuerpos desde todos los lados, la formación de enlaces cruzados se vuelve imposible y los complejos permanecen solubles.
Métodos de detección modernos
Hoy en día, para detectar antígenos o anticuerpos en líquidos biológicos se utilizan métodos de registro directo. En ellos, uno de los componentes se marca artificialmente para poder «visualizar» posteriormente el complejo formado.
Según el tipo de marcador, se distinguen:
- Métodos radioinmunoanalíticos (se emplean isótopos radiactivos).
- Enzimoinmunoanálisis / ELISA (se emplean enzimas). Existen diferentes modificaciones, como el método de doble sitio (sándwich, donde el antígeno queda atrapado entre dos anticuerpos distintos) o el competitivo.
- Métodos de inmunofluorescencia (se emplean colorantes fluorescentes o fluoróforos). Es el patrón de referencia (estándar de oro) para el estudio de receptores celulares de superficie, especialmente mediante citometría de flujo láser.
Diferencia importante entre los linfocitos T y B: mientras que las células B y los anticuerpos son capaces de unirse a antígenos libres directamente en solución, las células T los reconocen exclusivamente en forma asociada a membrana, como un «lo propio modificado».
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué enzimas se utilizan como marcadores en el enzimoinmunoanálisis?
Como marcadores en el enzimoinmunoanálisis se emplean enzimas capaces de catalizar una reacción coloreada al añadir un sustrato cromógeno.
Entre las principales enzimas utilizadas se encuentran:
- Peroxidasa de rábano picante: el marcador enzimático empleado con mayor frecuencia.
- Fosfatasa alcalina: otra enzima ampliamente utilizada en sistemas de prueba.
- $\beta$-galactosidasa: se utiliza como parte de conjugados para la detección de inmunocomplejos.
¿Cuáles son las principales modificaciones del enzimoinmunoanálisis (ELISA)?
Las principales variantes del enzimoinmunoanálisis de fase sólida son el formato competitivo y el de doble sitio.
- Variante competitiva: se emplea para la determinación de anticuerpos frente a antígenos conocidos. El método se basa en la competencia por la unión al antígeno adsorbido entre los anticuerpos marcados añadidos y los anticuerpos no marcados problema.
- Variante de doble sitio (método sándwich): se utiliza para detectar antígenos que poseen más de un tipo de epítopo. En la fase sólida se fijan anticuerpos contra el primer epítopo y, tras la unión del antígeno, se añaden anticuerpos marcados contra el segundo epítopo.
¿Qué factores físico-químicos del medio influyen en la interacción entre antígeno y anticuerpo?
La fuerza iónica de la solución afecta a la estabilidad de la interacción antígeno-anticuerpo: su aumento puede tener un efecto destructivo sobre los inmunocomplejos y emplearse para evaluar la avidez.
¿Qué es la maduración de la afinidad y en qué estructuras de los órganos linfoides se produce?
La maduración de la afinidad es el proceso mediante el cual, durante el desarrollo de la respuesta inmunitaria, la afinidad de los anticuerpos por el antígeno aumenta significativamente (desde $10^{-7}-10^{-8}$ M hasta $10^{-10}-10^{-11}$ M).
Este proceso tiene lugar en las siguientes estructuras de los órganos linfoides:
- Centros germinales: ubicados en los ganglios linfáticos sistémicos, donde los linfocitos T colaboradores foliculares ayudan a los linfocitos B en la maduración de la afinidad.
- Zona oscura del centro reactivo: localizada en los folículos linfoides de las mucosas, a donde migran las células B activadas para experimentar mutagénesis somática y aumentar su afinidad.
La afinidad es la firmeza de un solo apretón de manos (un epítopo). La avidez es la fuerza de un abrazo grupal (un antígeno completo con múltiples epítopos).
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué es necesaria una rigurosa complementariedad para la formación del complejo?
Las fuerzas intermoleculares (especialmente las fuerzas de van der Waals) actúan únicamente a distancias infinitesimales. Sin una coincidencia espacial ideal de las superficies, las moléculas simplemente no podrán acercarse lo suficiente para que estas fuerzas actúen.
¿Qué ocurre en caso de exceso de anticuerpos en la reacción de precipitación?
Se produce el fenómeno de «bloqueo» del antígeno. Todos los epítopos accesibles de la molécula de antígeno son ocupados rápidamente por los anticuerpos, lo que impide la formación de enlaces cruzados entre las moléculas para formar una red grande. Como resultado, no precipita ningún sedimento y se forman pequeños complejos solubles.
¿Cómo influye la heterogeneidad de los anticuerpos en la evaluación de sus propiedades?
En el suero normal existen anticuerpos policlonales con una afinidad muy variable, lo que dificulta enormemente los cálculos precisos. Para mediciones estandarizadas se emplean anticuerpos monoclonales, los cuales poseen una afinidad absolutamente idéntica.
Qué más repasar sobre el tema
- Cálculo matemático de la afinidad: ecuación de Scatchard y método de diálisis de equilibrio
- Esquemas para la realización del enzimoinmunoanálisis de fase sólida (ELISA) y sistemas de amplificación de señal (biotina-estreptavidina)
- El papel del sistema del complemento en las reacciones de lisis inmunitaria y linfocitotoxicidad
- Métodos de inmunodifusión radial e inmunoblotting en el diagnóstico de laboratorio
- Características del reconocimiento de antígenos asociados a membrana por los linfocitos T (el concepto de «lo propio modificado»)
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