Reacción de precipitación

Principios generales de la formación del precipitado

Para que las moléculas solubles formen un complejo inmune grande que precipite, se requiere mantener un equilibrio. La interacción debe ocurrir en la llamada zona de equivalencia, es decir, en proporciones iguales y óptimas de antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac).

Si uno de los componentes se encuentra en gran exceso, se altera la formación de la red macromolecular y no se produce turbidez visible. En inmunología, este fenómeno se describe como el fenómeno de prozona o postzona. Dependiendo de los objetivos del estudio, la reacción se realiza en medios líquidos convencionales (en tubos de ensayo) o se utiliza gel semisólido (por lo general, agar).

Realización de la reacción en medio líquido

En medio líquido, la reacción se lleva a cabo en tubos de ensayo estrechos especiales. La variante clásica es la reacción de anular precipitación.

• Metodología: La solución con antígenos se superpone con mucho cuidado sobre el suero inmune. Es sumamente importante evitar la mezcla mecánica de los líquidos para conservar una interfaz clara.
• Mecanismo: Debido a la difusión gradual de las moléculas en la frontera de los medios, se alcanza la proporción óptima de los componentes. Incluso si el antígeno se encuentra en exceso en la capa superior, el gradiente de concentración iguala las proporciones.
• Resultado: En la zona de equivalencia se forma un anillo blanco opaco de precipitado.

Casos particulares:

1. Reacción de termoprecipitación (Ascoli). Se emplea en el diagnóstico del ántrax. Su característica distintiva es que como antígenos se utilizan extractos acuosos filtrados de tejidos afectados, los cuales se someten previamente a ebullición.
2. Reacción de floculación (de Ramon). Del latín floccus (copopo de lana). Al interactuar los reactivos en el tubo de ensayo, aparece una opalescencia característica o se forma una masa flocular grumosa.

Métodos en gel: doble inmunodifusión (de Ouchterlony)

Este método se utiliza para el análisis cualitativo de la identidad antigénica. El medio empleado es una capa delgada de gel de agar extendida sobre un portaobjetos de vidrio. En ella se perforan pozos a una distancia de 2–3 mm entre sí, donde se colocan por separado los antígenos y el suero.

A continuación, comienza la difusión en contra: los componentes se desplazan por el interior del gel uno hacia el otro. En el lugar donde sus concentraciones se vuelven equivalentes, precipita un sedimento en forma de línea blanca (banda de precipitación). Si el sistema es multicomponente, surge todo un espectro de dichas líneas.

Por la naturaleza de la intersección de las líneas, se determina el grado de parentesco de los antígenos:

• Idénticos: Las líneas de los pozos adyacentes se fusionan suavemente en un solo arco. Esto indica una coincidencia completa de los epítopos.
• No idénticos: Las líneas se cruzan en forma de cruz. Las reacciones ocurren de manera independiente, sin determinantes comunes.
• Parcialmente idénticos: La línea se fusiona, pero uno de sus extremos sobrepasa el punto de unión, formando un «espolón». Esto significa que uno de los antígenos posee determinantes adicionales.

Análisis cuantitativo: inmunodifusión radial (método de Mancini)

A diferencia del método de Ouchterlony, aquí los anticuerpos no se encuentran en un pozo separado. El suero inmune monoespecífico se mezcla con agar fundido para que los anticuerpos se distribuyan uniformemente por todo el volumen del gel.

Tras la solidificación del medio, se practican pozos en él y se añade el antígeno de estudio en diferentes diluciones. El antígeno difunde en el gel de forma radial en todas direcciones, encontrándose con los anticuerpos. Como resultado, alrededor de cada pozo se desarrolla una zona de precipitación anular.

El método permite determinar con gran precisión la concentración de proteínas, ya que el diámetro del anillo formado es proporcional a la concentración del antígeno. Para los cálculos, se traza una curva de calibración (la dependencia del cuadrado del diámetro del anillo con respecto a la concentración) utilizando muestras estándar. En la práctica clínica, el método de Mancini se emplea para medir el nivel de diversas clases de inmunoglobulinas (IgG, IgM) y componentes del sistema del complemento en la sangre.

Inmunoelectroфoresis

Este método combinado se utiliza para descifrar mezclas muy complejas de antígenos. Combina el alto poder de resolución de un campo eléctrico con la estricta especificidad de la inmunoprecipitación.

El proceso transcurre en dos etapas:

1. Separación: La mezcla de antígenos se coloca en el gel y se aplica una corriente eléctrica. Las moléculas se separan en fracciones invisibles según su carga y masa.
2. Inmunodifusión: En paralelo a las zonas separadas se practica una canaleta larga y se llena con suero inmune. Los anticuerpos comienzan a difundir hacia los antígenos separados.

En las zonas de equivalencia aparecen arcos de precipitación específicos, cada uno de los cuales corresponde a un componente individual de la compleja mezcla inicial.

En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema

Preguntas de clases y exámenes

Qué más repasar sobre el tema

• Efecto del exceso de reactivos en la formación de complejos inmunes (fenómeno de prozona)
• Principios para la elaboración de la curva de calibración en el método de Mancini
• Características de la difusión de macromoléculas en gel de agar
• Estructura de los determinantes antigénicos y formación del «espolón» de precipitación

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