Mecanismo de interacción entre antígeno y anticuerpo
Cualquier reacción inmunodiagnóstica in vitro transcurre en dos fases sucesivas:
- Fase específica. Ocurre rápidamente y es invisible a simple vista. El mecanismo consiste en la unión del centro activo (fragmento Fab) del anticuerpo con el determinante (epítopo) del antígeno. La interacción se logra mediante fuerzas físico-químicas: enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones hidrófobas. La eficacia depende de la afinidad (la afinidad del anticuerpo por el epítopo) y la avidez (la fuerza de unión total).
- Fase no específica. Una etapa más lenta que requiere la presencia de electrolitos y un nivel óptimo de pH. Es precisamente en esta fase donde el resultado de la reacción se vuelve físicamente visible, por ejemplo, en forma de turbidez o formación de flóculos (fenómeno de aglutinación).
Estrategia del método serológico
El método serológico está dirigido a establecer un diagnóstico mediante la detección de anticuerpos o antígenos en el suero sanguíneo del paciente. Dado que en la reacción un componente siempre es conocido y el segundo se busca, son posibles dos variantes:
- Serodiagnóstico (búsqueda de anticuerpos). Como «cebo» se utilizan antígenos conocidos: diagnosticadores. Si en el suero del paciente hay anticuerpos específicos, estos se unirán al diagnosticador.
- Identificación (búsqueda de antígeno). Para determinar la pertenencia de especie o tipo de un microorganismo aislado del paciente, se utilizan sueros de diagnóstico inmune. Estos se obtienen mediante hiperinmunización de animales de laboratorio (por ejemplo, conejos), por lo que garantizan la presencia de los anticuerpos necesarios.
Reacción de aglutinación: etapas y variantes
La aglutinación se emplea para aglutinar antígenos corpusculares (bacterias, eritrocitos).
Etapa A: Reacción orientativa. Se realiza en un portaobjetos para determinar preliminarmente la especie de la bacteria. Se mezcla una gota de suero diagnóstico en baja dilución (1:10 o 1:20) con un cultivo puro del patógeno. La aparición de un sedimento flocular indica un resultado positivo. Es obligatorio el control: solución salina más cultivo (para excluir la aglutinación espontánea).
Etapa B: Reacción ampliada. Se realiza en tubos de ensayo para confirmar la especificidad y determinar el título. El suero se diluye secuencialmente (se titula) y se añade la suspensión del patógeno. Se considera positiva la reacción en la que la cantidad de sedimento y la aclaración del líquido se observan en una dilución cercana al valor de referencia (título) del suero.
Reacción de hemoaglutinación indirecta (RHI). Se utilizan eritrocitos de carnero (o látex) como portadores.
- RHI clásica: en los eritrocitos se adsorben antígenos (diagnosticador antigénico). Se emplea para buscar anticuerpos en infecciones.
- RHI inversa: en los eritrocitos se adsorben anticuerpos. Busca antígenos (por ejemplo, toxina botulínica) u hormonas (gonadotropina coriónica en pruebas de embarazo).
Lectura de resultados de la RHI: una reacción positiva se ve como un «paraguas» (los eritrocitos cubren el fondo del pocillo, con borde festoneado). La negativa, como un «botón» compacto en el centro.
Reacción de fijación del complemento (RFC)
Una reacción compleja de dos fases. Antes de realizarla, el suero del paciente se calienta obligatoriamente a 56 °C para inactivar su propio complemento, de lo contrario distorsionará los resultados.
- Fase principal. Se incuban tres componentes: antígeno, anticuerpo y complemento exógeno estrictamente dosificado. Si el Ag y el Ac coinciden, se forma un complejo inmune que fija (consume) todo el complemento añadido.
- Fase indicadora. Se añade a la sistema el sistema hemolítico (eritrocitos de carnero + suero hemolítico con anticuerpos contra ellos). El objetivo es visualizar la presencia de complemento libre.
Interpretación:
- Positivo (+): En la primera fase el complemento se unió al complejo inmune. No queda complemento para la segunda fase. No hay hemólisis, los eritrocitos sedimentan en el fondo.
- Negativo (–): En la primera fase no se formó el complejo, el complemento quedó libre. En la segunda fase ataca a los eritrocitos, formando el complejo de ataque a la membrana. Ocurre hemólisis y el líquido se vuelve rojo transparente («sangre lacada»). Un ejemplo histórico de este método es el diagnóstico de sífilis (reacción de Wassermann).
Métodos en fase sólida e inmunodifusión
Además de las reacciones clásicas, se emplean activamente métodos que utilizan marcadores enzimáticos y difusión en gel.
- Determinación de anticuerpos (serodiagnóstico): En los pocillos de una fase sólida se sorbe un antígeno conocido. Se añade el suero en estudio y luego un suero antiglobulina marcado con enzima. Tras la adición del sustrato cromógeno, la presencia de anticuerpos se confirma por un cambio de color.
- Determinación de antígenos: En el soporte se fijan anticuerpos. Tras añadir el material, la estructura buscada se revela con suero inmune con enzima y sustrato.
- Difusión radial: Se realiza en gel de agar que contiene eritrocitos de carnero y complemento. Se añade suero hemolítico en los pocillos. Los anticuerpos difunden radialmente, formando una zona visible de hemólisis alrededor del pocillo.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué enzimas se utilizan como marcadores en el ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA)?
Como marcadores enzimáticos en el ensayo inmunoenzimático se emplean tres sustancias principales. Estas incluyen:
- Peroxidasa de rábano — se utiliza para escindir el sustrato y cambiar el color del producto de la reacción.
- Beta-galactosidasa ($\beta$-galactosidasa) — actúa como un marcador enzimático específico.
- Fosfatasa alcalina — se utiliza como parte del conjugado para detectar el complejo «antígeno-anticuerpo».
Estas enzimas se unen químicamente a los anticuerpos formando un reactivo clave (conjugado) que, tras la adición del cromógeno, permite visualizar y cuantificar los resultados del estudio.
¿Qué clases de inmunoglobulinas poseen mayor avidez y capacidad de aglutinación?
Según las fuentes, las inmunoglobulinas de la clase M (IgM) poseen la mayor capacidad de aglutinación. La IgM tiene una estructura pentamérica y 10 sitios de unión al antígeno, por lo que puede unir varias bacterias o células formando grandes conglomerados. La IgG tiene una estructura monomérica y también participa en la formación de redes entre células adyacentes. Las fuentes no establecen que la IgM posea mayor avidez en comparación con otras clases de inmunoglobulinas.
¿Qué reacciones epónimas se aplican en la clínica como reacción de aglutinación ampliada?
La reacción de Widal es una reacción de aglutinación ampliada mencionada como método aplicado históricamente en el diagnóstico serológico de infecciones asociadas a enterobacterias.
¿Qué partículas corpusculares pueden actuar como portadores de antígenos en las reacciones de aglutinación indirecta?
En las reacciones de aglutinación indirecta, las siguientes partículas corpusculares pueden actuar como portadores de antígenos o anticuerpos:
- Eritrocitos — se utilizan en la reacción de hemoaglutinación indirecta. En su superficie se adsorben antígenos solubles, lo que permite visualizar la formación de complejos inmunes en forma de aglutinación celular.
- Partículas de látex — se emplean en la aglutinación de látex. Pueden ser partículas de poliestireno coloreadas o superparamagnéticas, sensibilizadas con anticuerpos o antígenos específicos.
Cómo recordar el resultado de la RFC: «Si el antígeno y el anticuerpo coinciden, 'consumen' el complemento. Los eritrocitos no reciben complemento y permanecen intactos (no hay hemólisis, la reacción es positiva)».
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué se calienta el suero a 56 °C al realizar la prueba de fijación del complemento (RFC)?
Esta es una etapa crítica para inactivar el propio complemento del paciente. Si no se hace esto, una cantidad incontrolada de complemento endógeno provocará una hemólisis falsa en la segunda fase.
¿Cómo distinguir visualmente una reacción de IHA positiva de una negativa?
En una reacción positiva, los eritrocitos se aglutinan y sedimentan en forma de «paraguas» con bordes festoneados. En la negativa, se deslizan hacia el centro del pocillo formando un «botón» compacto.
¿Qué es la avidez de los anticuerpos?
La avidez es un indicador que caracteriza la fuerza de unión total entre el anticuerpo y el antígeno. Depende de la afinidad (afinidad por un epítopo específico) y del número de enlaces formados.
¿Para qué se establecen controles en la reacción de aglutinación en placa?
El control «bacterias + solución salina» es necesario para asegurar la ausencia de aglutinación espontánea del cultivo del patógeno. Lo normal es que se observe una turbidez uniforme sin sedimento.
Qué más repasar sobre el tema
- Estructura y funciones del fragmento Fab del anticuerpo
- Naturaleza de las interacciones físico-químicas (fuerzas de van der Waals, enlaces hidrófobos) en la fase específica
- Preparación y estandarización de diagnosticadores eritrocitarios para IHA y RIHA
- Mecanismo de formación del complejo de ataque a la membrana en la hemólisis
- Evaluación de la actividad del complemento y del suero hemolítico
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