Métodos modernos de inmunodiagnóstico

Radioinmunoanálisis (RIA)

El método radioinmunoanalítico se basa en una reacción altamente sensible de unión de antígeno a anticuerpo. El papel del marcador indicador lo desempeñan aquí los radionúclidos; con mayor frecuencia se utilizan isótopos de yodo, carbono o tritio.

Técnicamente, el proceso de estudio se reduce a la separación del complejo inmune radiactivo formado y a la posterior medición del nivel de radiación beta o gamma mediante un contador especial. La intensidad de la radiación registrada se encuentra en dependencia matemática directa con el número de moléculas unidas.

Existen dos variantes principales para la realización de la reacción:

• RIA en fase sólida. Uno de los componentes reactivos (antígeno o anticuerpo) se sorbe previamente sobre un soporte sólido, por ejemplo, en los pocillos de una placa de poliestireno.
• RIA competitivo. Se emplea para una cuantificación precisa. El antígeno buscado de la muestra del paciente y el antígeno marcado estándar añadido compiten por un grupo limitado de anticuerpos.

El método posee una sensibilidad colosal, captando concentraciones menores de sustancias, aunque presenta un cierto peligro ecológico debido a la necesidad de trabajar con fuentes de radiación. Mediante este método, los laboratorios determinan los niveles de hormonas, enzimas, fármacos, inmunoglobulinas y antígenos microbianos.

Inmunotransferencia (Western blot)

La inmunotransferencia, también conocida como Western blot, constituye un enfoque diagnóstico complejo que combina las capacidades de la electroforesis, la transferencia de fracciones y el análisis inmunoenzimático (o radioinmunoanálisis). Es una herramienta indispensable para el diagnóstico confirmatorio, cuyo ejemplo clásico es la verificación de la infección por VIH.

El estudio se lleva a cabo en tres etapas sucesivas:

1. Electroforesis. Los antígenos del patógeno se separan en un gel de poliacrilamida bajo la influencia de una corriente eléctrica. Las fracciones se distribuyen estrictamente en función de su masa molecular y carga.
2. Inmunotransferencia (transferencia/blotting). Los antígenos separados se replican desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa. Al mismo tiempo, se conserva la disposición topográfica exacta de las bandas invisibles (blots).
3. Revelado. En la etapa diagnóstica se utilizan tiras comerciales prefabricadas (strips) con los blots aplicados. Sobre ellas se aplica el suero del paciente en estudio. Si en la sangre hay anticuerpos específicos presentes, estos se unen a los antígenos. Tras el lavado de los elementos no unidos, se añaden anticuerpos secundario antiespecie (contra inmunoglobulinas humanas) que portan un marcador enzimático. La adición de un cromógeno provoca un cambio de color en el sustrato y se visualizan bandas nítidas en la membrana.

Microscopía electrónica inmune

Este método combina de manera elegante el poder de resolución de la microscopía electrónica con la especificidad de las reacciones serológicas. El propósito principal del método es el estudio visual detallado de microorganismos, predominantemente virus.

Al tratar partículas virales con un suero inmune específico, se produce la formación de grandes agregados inmunes. Los anticuerpos rodean densamente a los viriones, creando a su alrededor un «halo» o corona proteica peculiar. Esta capa proporciona un marcado contraste óptico-electrónico, gracias al cual las partículas virales y sus cúmulos se vuelven claramente visibles.

Para una intensificación adicional de la visibilidad, se aplica un marcado con marcadores densos a los electrones. En particular, los anticuerpos se conjugan con ferritina, una proteína especial rica en hierro que retiene excelentemente el haz de electrones y ayuda a localizar los antígenos buscados.

Citometría de flujo

La citometría de flujo es un método instrumental para el análisis de poblaciones celulares, la diferenciación de células sanguíneas y su identificación mediante antígenos CD de superficie.

Antes de comenzar el análisis, la suspensión celular se tiñe específicamente con anticuerpos monoclonales previamente marcados con fluorocromos. En el propio citómetro se implementa el principio de enfoque hidrodinámico: las células se alinean en el capilar formando una sola fila y cruzan la zona de irradiación láser estrictamente de una en una.

El láser cumple dos tareas clave:

• Evaluación de la morfología. El detector de dispersión de luz frontal registra el tamaño y la granularidad interna de la célula que pasa.
• Evaluación de marcadores. El láser excita la emisión de los marcadores fluorocrómicos adheridos. La intensidad de la fluorescencia refleja la densidad de los antígenos CD en la membrana.

El complejo sistema óptico del aparato utiliza espejos dicroicos para separar la luz emitida según las longitudes de onda (por ejemplo, el espectro verde de 530–550 nm y el rojo de 560–580 nm). La señal dirigida hacia los fotomultiplicadores se convierte en un histograma gráfico.

En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema

Qué más repasar sobre el tema

• Mecanismos de apoptosis y piroptosis evaluados mediante citometría de flujo
• El espectro de antígenos CD y su papel en la identificación de linfocitos
• Bandas proteicas específicas (blots) que tienen importancia en el diagnóstico de la infección por VIH
• Principios físicos de funcionamiento de los fotomultiplicadores en la citofluorometría láser
• Isótopos utilizados en el radioinmunoanálisis y su seguridad fisiológica

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