Principio general y mecanismo de la reacción
En el ensayo inmunoenzimático (ELISA), un papel clave es desempeñado por el conjugado: anticuerpos a los que se ha unido químicamente una enzima. Con mayor frecuencia se utilizan como marcadores la peroxidasa de rábano picante, la $\beta$-galactosidasa o la fosfatasa alcalina.
La reacción transcurre en varias etapas:
- Formación del complejo inmune «antígeno-anticuerpo».
- Adición de un sustrato o cromógeno especial.
- La enzima presente en el conjugado escinde el sustrato.
- Como resultado de la escisión, el color de la solución cambia.
La intensidad de la coloración resultante depende directamente de la cantidad de moléculas que se han unido. Esto permite realizar una evaluación cuantitativa de la sustancia analizada. Para detener la reacción en el momento deseado, se añade ácido a la mezcla, lo que desnaturaliza la enzima.
ELISA en fase sólida
La mayor difusión la ha obtenido el ELISA en fase sólida (ELISA). Su principal característica es que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo) está fijado (sorbido) previamente sobre un soporte sólido. Generalmente, el papel de soporte lo desempeñan los pocillos de placas de poliestireno.
Una condición fundamental para la realización exitosa del ELISA en fase sólida es el lavado minucioso de los pocillos de la placa tras cada adición de un reactivo nuevo. Esto es necesario para eliminar por completo todas las moléculas no unidas, con el fin de prevenir la aparición de resultados falsos positivos.
Principales variantes de ELISA
Dependiendo de los objetivos diagnósticos, se emplean diferentes esquemas de análisis:
- Detección de anticuerpos (serodiagnóstico): El objetivo es encontrar inmunoglobulinas específicas contra el patógeno en el suero del paciente. En el fondo del pocillo se fija un antígeno conocido. Al añadir el suero del paciente, sus anticuerpos (si los hay) se unen al antígeno. A continuación, se añade el conjugado (suero antiglobulina con enzima), que se acopla a los fragmentos Fc de los anticuerpos del paciente. La adición de sustrato provoca la coloración.
- Detección de antígenos («método de sándwich»): Se utiliza para buscar el propio patógeno o sus partículas. En el pocillo se fijan anticuerpos diagnósticos. Estos «capturan» el antígeno buscado del suero del paciente. Después de esto, se introducen anticuerpos marcados contra el mismo antígeno, los cuales cierran el complejo («sándwich»). La presencia de la enzima se confirma mediante una reacción de color.
- ELISA competitivo: El método se basa en la competición de moléculas por un número limitado de sitios de unión. Por ejemplo, al buscar un antígeno, el antígeno buscado del paciente y el antígeno estándar marcado añadido compiten por unirse a los anticuerpos.
Aplicación en la práctica clínica
Gracias a su altísima sensibilidad (detección de concentraciones de hasta $10^{-10}$ — $10^{-12}$ g/L), el ELISA se utiliza ampliamente en la medicina moderna.
Principales ámbitos de uso:
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas: virales (incluyendo hepatitis B y VIH), bacterianas, parasitarias.
- Determinación cuantitativa de moléculas biológicamente activas, tales como hormonas y enzimas.
- Monitoreo de la concentración de fármacos en el organismo.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué clases de anticuerpos (inmunoglobulinas) se determinan de forma diferencial mediante ELISA para evaluar la etapa del proceso infeccioso?
Mediante ELISA se determinan diferencialmente las inmunoglobulinas de las clases M y G.
- Inmunoglobulinas de clase M (IgM): marcador de infección reciente; en la infección por virus del herpes, un aumento del título de IgM en 4 o más veces indica infección primaria.
- Inmunoglobulinas de clase G (IgG): en la infección por virus del herpes, el incremento del título indica una forma recidivante de la enfermedad; en la infección por rotavirus, la inmunidad postinfecciosa está mediada por anticuerpos de clase IgG.
Para recordar la esencia del método de sándwich, imagine un emparedado: el trozo de pan inferior son los anticuerpos fijados en el fondo del pocillo, el relleno (la carne) es el antígeno buscado de la sangre del paciente, y el trozo de pan superior son los anticuerpos marcados añadidos que cierran la estructura.
Preguntas de clases y exámenes
¿Qué es un conjugado en ELISA?
El conjugado son anticuerpos fuertemente unidos (conjugados) a una molécula de enzima, que sirve como marcador para la posterior visualización de la reacción.
¿Cuál es la diferencia entre el método directo y el indirecto de detección?
El esquema de búsqueda de anticuerpos en suero (serodiagnóstico) es un método indirecto, ya que el marcador enzimático se encuentra en los anticuerpos secundarios (antiglobulina), mientras que el método de sándwich está dirigido a la búsqueda de antígenos.
Qué más repasar sobre el tema
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