Principios de funcionamiento y óptica
La principal diferencia entre el microscopio electrónico y el óptico es el uso de un flujo de electrones como fuente de radiación. La longitud de onda de los electrones es sustancialmente más corta que la de la luz visible. La onda corta sortea fácilmente los obstáculos más pequeños, lo que garantiza una capacidad de resolución sumamente alta del aparato.
En lugar de lentes de vidrio, se emplean bobinas electromagnéticas que focalizan el haz de electrones. Dentro de la columna del aparato se debe mantener necesariamente un alto vacío; esto es indispensable para que los electrones no pierdan energía al chocar con las moléculas de gas.
Clasificación de los microscopios electrónicos
Dependiendo de cómo interactúe el haz de electrones con la muestra, se distinguen dos tipos principales de aparatos:
- Microscopios electrónicos de transmisión (MET): El haz de electrones atraviesa el objeto por completo. A la salida se obtiene una imagen bidimensional (plana) de la estructura interna de la célula.
- Microscopios electrónicos de barrido (MEB): Se aplica un recubrimiento metálico fino sobre la superficie del objeto de estudio. El haz de electrones escanea secuencialmente esta superficie, extrayendo electrones secundarios del metal (rayos beta). El registro de estos rayos produce una imagen tridimensional (volumétrica) del relieve.
Esquema óptico del microscopio electrónico de transmisión (MET)
En el MET, los electrones son emitidos por el cátodo y acelerados gracias a la diferencia de potencial con el ánodo. Tras pasar a través de un orificio en el ánodo, el flujo entra en el sistema de vacío de las lentes electromagnéticas:
- El condensador dirige y focaliza el haz sobre la muestra.
- El objetivo recoge los rayos que han atravesado el tejido, proporcionando el aumento primario.
- La lente proyectora (que cumple la función de ocular) forma la imagen definitiva.
La imagen se visualiza en una pantalla luminiscente, la cual comienza a brillar allí donde inciden los electrones.
Preparación de la muestra para MET
El proceso de preparación de muestras tiene una serie de requisitos estrictos. Se toman trozos de tejido muy pequeños (de aproximadamente 1 mm³). La fijación se realiza en dos etapas:
- Primero con glutaraldehído (para fijar las proteínas).
- Luego con tetróxido de osmio (para fijar los fosfolípidos de las membranas y conferirles la densidad electrónica inicial).
Tras la deshidratación, el material no se incluye en parafina, sino en resinas epoxídicas. Los bloques se polimerizan en una estufa.
El corte se realiza con ultratomos. Los cortes obtenidos, con un grosor de 30–50 nm, se colocan sobre rejillas metálicas especiales.
Contraste (tinción)
En microscopía electrónica no se utiliza el término «tinción», sino que se habla de contraste. Para ello se emplean sales de metales pesados (tungsteno, plomo, uranio).
Los metales pesados se depositan sobre las estructuras celulares (principalmente sobre los fosfolípidos de las membranas) y absorben los electrones. Aquellas zonas de la muestra donde se han acumulado muchas sales retienen el haz de electrones y se ven oscuras en la pantalla luminiscente.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué reactivos se emplean para la deshidratación del tejido antes de la inclusión en resinas epoxídicas?
Para la deshidratación del tejido antes de la inclusión se emplean alcoholes de concentración creciente.
- Alcohol: se utiliza para la deshidratación gradual del material en forma de soluciones con una concentración del 70° al 100°.
El proceso consiste en el procesamiento secuencial de la muestra a través de una «batería» de alcoholes. Tras la eliminación completa del agua del tejido, se pasa a la siguiente etapa: la impregnación y la inclusión del material en medios de endurecimiento, para lo cual se emplean resinas sintéticas.
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué se necesita vacío en el microscopio electrónico?
El alto vacío es necesario para que el flujo de electrones no se disperse ni pierda energía al chocar con las moléculas de aire dentro del tubo.
¿Cuál es la diferencia entre el microscopio de transmisión y el de barrido?
El microscopio de transmisión (MET) hace pasar los electrones a través de un corte fino, proporcionando una imagen plana del interior celular. El de barrido «explora» la superficie del objeto cubierta de metal, creando una imagen tridimensional del relieve.
¿Qué se utiliza en lugar de los portaobjetos en la microscopía electrónica?
En lugar de portaobjetos, se emplean rejillas metálicas especiales que sostienen los cortes ultrafinos.
¿Para qué se necesita el osmio durante la preparación de las muestras?
El tetróxido de osmio se utiliza para la doble fijación: estabiliza los fosfolípidos de las membranas y al mismo tiempo contrasta las estructuras, otorgándoles densidad electrónica.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismos de formación de la imagen en el microscopio electrónico de barrido
- Comparación de las etapas de procesamiento para microscopía óptica y electrónica
- Principio de funcionamiento del ultratomo
- Características de la aplicación del glutaraldehído y de las resinas epoxídicas
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