Factores de solubilidad y carga eléctrica
La capacidad de las proteínas para disolverse en agua depende tanto de sus características propias (relación de radicales polares y no polares, resistencia a la desnaturalización) como de los parámetros del medio: temperatura, composición salina, presencia de sustancias orgánicas y el índice de acidez (pH).
Un papel clave lo desempeña la carga neta de la molécula. Esta se forma debido a los grupos ionizados de los aminoácidos: grupos carboxilo negativos y grupos amino positivos. Cambiar el pH del medio altera este balance:
- En medio ácido (con exceso de protones de hidrógeno), se suprime la disociación de los grupos carboxilo. La proteína pierde cargas negativas y se vuelve más positiva.
- En medio alcalino (con exceso de iones hidroxilo), los protones se separan de los grupos amino, volviéndolos neutros. Como resultado, la proteína pierde la carga positiva y se vuelve más negativa.
Punto isoeléctrico (pI)
Existe un valor de pH determinado en el cual la cantidad de grupos cargados positiva y negativamente en la molécula proteica se iguala. Este estado se denomina punto isoeléctrico.
En el estado isoeléctrico, la carga neta de la proteína es cero. Como resultado, desaparecen las fuerzas de repulsión electrostática entre las moléculas, estas comienzan a adherirse entre sí (agregar) y precipitan. Precisamente en el pI la solubilidad de la proteína es mínima.
Un claro ejemplo de este proceso es el cuajado de la leche. En la leche fresca, las moléculas de la proteína caseína están cargadas negativamente y forman una solución coloidal estable. Cuando las bacterias se multiplican, liberan ácido láctico, el cual reduce el pH. Cuando la acidez alcanza el punto isoeléctrico de la caseína (alrededor de 4.6), su carga se neutraliza, las moléculas dejan de repelerse y la leche se cuaja.
Principios de aislamiento y purificación de proteínas
Para estudiar las propiedades de una proteína específica, es necesario extraerla de las células y purificarla. El algoritmo estándar incluye varias etapas:
- Ruptura celular para obtener un homogenado.
- Fraccionamiento (centrifugación): separación de la mezcla en fracciones nuclear, mitocondrial, citosólica y otras, para aislar aquella donde se encuentra la proteína buscada.
- Desnaturalización térmica selectiva: calentamiento breve. Si la proteína deseada es termoestable, el calentamiento hará que las impurezas termolábiles se desnaturalicen y precipiten, dejando la proteína diana en solución.
- Salting-out (salado): adición de sales (más frecuentemente sulfato de amonio). Las proteínas con menor solubilidad precipitan a bajas concentraciones de sal. Aumentando gradualmente la concentración, se puede separar la mezcla en fracciones individuales.
Separación de proteínas por masa
Para separar macromoléculas según su tamaño y peso se emplean ultracentrifugación, electroforesis en gel de poliacrilamida y gelfiltración (cromatografía de exclusión molecular).
El principio de la gelfiltración se basa en hacer pasar la mezcla a través de una columna con gránulos porosos. Las proteínas grandes físicamente no pueden penetrar en los poros del gel; pasan por el espacio libre entre los gránulos y son eluidas de la columna primeras. Las moléculas pequeñas penetran en el interior de los poros, su recorrido se alarga considerablemente, por lo que abandonan la columna últimas.
Otro método importante es la electroforesis en papel, que separa las proteínas en un campo eléctrico. En el suero sanguíneo de una persona sana, las albúminas se mueven más rápido hacia el ánodo (la fracción más grande, 54–58%). Les siguen las globulinas (alfa-1, alfa-2 y beta). La menor movilidad la presentan las gammaglobulinas, que forman la fracción catódica.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué sales, además del sulfato de amonio, se emplean para la precipitación salina de proteínas?
Para la precipitación salina de proteínas, además del sulfato de amonio, se emplean sulfato de sodio y cloruro de sodio.
El salting-out es la precipitación reversible de una proteína a partir de una solución mediante el uso de altas concentraciones de sales neutras. Losiones de la sal se hidratan, quitando agua a las moléculas proteicas y neutralizando su carga, lo que conduce a la agregación y precipitación de las proteínas.
¿Con qué reactivos químicos se realiza la precipitación irreversible de las proteínas?
La precipitación irreversible (desnaturalización) de las proteínas se realiza con los siguientes reactivos químicos:
- Ácidos y álcalis: alteran la ionización de los grupos ionizables, rompiendo los enlaces iónicos y de hidrógeno.
- Disolventes orgánicos (alcohol, fenol, cloramina): destruyen las interacciones hidrófobas y los enlaces de hidrógeno.
- Sales de metales pesados: forman sales insolubles de proteínas.
- Urea: destruye los enlaces de hidrógeno intramoleculares.
- Detergentes.
¿A qué se deben las propiedades tampón de las soluciones de proteínas?
Las propiedades tampón de las soluciones de proteínas se deben a la presencia en sus moléculas de grupos amino y carboxilo, que pueden actuar como ácidos y bases.
La composición del sistema tampón proteico incluye la molécula de proteína (NH₂-Prot-COOH) y su sal (NH₂-Prot-COONa). Ante la entrada de un ácido, la proteína se une a los protones, y ante la entrada de bases, cede protones, manteniendo así el pH del medio. La capacidad tampón de las proteínas frente a los ácidos es mayor que frente a los álcalis.
¿Qué tipos de enlaces químicos se destruyen durante la desnaturalización térmica de una proteína?
Durante la desnaturalización térmica de una proteína se destruyen los enlaces débiles que estabilizan su estructura terciaria y secundaria.
Entre estos enlaces se encuentran:
- Enlaces de hidrógeno.
- Interacciones hidrófobas.
- Enlaces iónicos.
La destrucción de estos enlaces ocurre debido al incremento del movimiento caótico de las moléculas a altas temperaturas (superiores a 60 °C), mientras que los enlaces peptídicos (estructura primaria) se conservan.
Para no confundir los resultados de la gelfiltración, imagine que los gránulos de gel son casas con puertas estrechas. Las moléculas "gordas" (grandes) no pueden entrar a la casa, por lo que corren rápidamente por la calle y llegan a la meta primeras. Las moléculas "flacas" (pequeñas) entran en cada puerta, deambulan largamente por las habitaciones y llegan últimas.
Preguntas de clases y exámenes
¿Por qué una proteína desnaturalizada precipita más fácilmente?
Durante la desnaturalización se altera la estructura espacial de la molécula, y los radicales hidrófobos de los aminoácidos, que normalmente están ocultos en el interior, quedan expuestos en la superficie. Esto reduce drásticamente la solubilidad de la proteína en agua.
¿Qué valor de pH es necesario establecer para que un péptido con carga de -1 alcance su punto isoeléctrico?
Dado que la carga del péptido es negativa, es necesario neutralizarla mediante la adición de protones (cargas positivas). Para ello, es preciso acidificar el medio, es decir, el pI se encontrará en un medio ácido (pH < 7).
¿Qué le ocurrirá a la carga de la proteína al añadir un álcali?
En un medio alcalino existe un exceso de iones hidróxido. Estos se unen a los protones, arrebatándoselos a los grupos amino. Como resultado, la carga positiva de la proteína disminuye y se vuelve más negativa.
Qué más repasar sobre el tema
- Reglas para calcular la carga neta del péptido a partir de los residuos de aminoácidos
- Proteinograma de una persona sana: porcentaje de las fracciones
- Principios de la electroforesis en gel de poliacrilamida (en presencia de SDS)
- Mecanismos moleculares de la precipitación salina reversible de proteínas
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