Cromatografia de proteínas

Gel-filtração: separação por massa molecular

Este método baseia-se no efeito de peneira molecular. A essência do processo consiste em peneirar as moléculas proteicas através de um suporte especializado — grânulos intumescidos de sefadex.

O sefadex em si é uma estrutura espacial complexa. Trata-se de cadeias tridimensionais de polissacarídeos de dextrana, dentro das quais são formados poros de um diâmetro específico. Ao passar a mistura através da coluna, a velocidade de avanço de diferentes proteínas depende diretamente de sua massa molecular.

A separação ocorre segundo o seguinte princípio:

• Moléculas de menor massa penetram livremente no espaço interno dos poros dos grânulos de sefadex. Por causa disso, seu caminho é prolongado, elas ficam retidas na coluna e saem dela consideravelmente mais tarde.
• Moléculas de grande massa, ao contrário, são fisicamente incapazes de entrar nos poros da dextrana. Elas contornam os grânulos pelo lado de fora e, portanto, eluem (são lavadas) mais rapidamente da coluna cromatográfica.

Cromatografia de troca iônica: o papel da carga elétrica

Este tipo de fracionamento baseia-se na interação eletrostática. O processo ocorre devido à ligação dos grupos ionizados das próprias proteínas com os grupos funcionais de carga oposta do suporte. Como tal suporte atuam as resinas de troca iônica — materiais poliméricos insolúveis especiais.

A regra chave do método: a força da adsorção (ligação da proteína à resina) é estritamente proporcional à magnitude da carga elétrica da molécula proteica. Quanto mais carregada estiver a proteína, mais firmemente ela se fixa no polímero.

Para remover a proteína isolada da coluna, aplica-se o procedimento de eluição (lavagem). As proteínas adsorvidas são lavadas com o auxílio de soluções de cloreto de sódio (NaCl). A concentração de sal é gradualmente aumentada durante esse processo. A lógica da eluição é a seguinte: quanto menor for a carga de uma proteína específica, menor será a concentração de NaCl necessária para romper sua ligação com os grupos ionogênicos da resina e lavá-la para o tubo de ensaio.

Cromatografia de afinidade: especificidade absoluta

Entre todas as abordagens analisadas, a cromatografia de afinidade destaca-se como o método mais específico para o isolamento de proteínas individuais. Ela permite "capturar" de forma direcionada a macromolécula desejada a partir de misturas altamente complexas.

O mecanismo deste método inclui várias etapas sequenciais:

1. Preparação do suporte: um ligante — molécula com a qual a proteína de interesse interage em condições naturais — é firmemente acoplado a um polímero quimicamente inerte por meio de ligação covalente.
2. Passagem da mistura: a solução de proteínas é aplicada à coluna. Nesse momento, ocorre uma ligação complementar estrita da proteína desejada com o ligante fixado.
3. Resultado final: apenas a proteína específica para aquele ligante em questão é adsorvida na coluna polimérica. Todas as outras proteínas (contaminantes) passam direto, sem retenção.

Questões de aulas e exames

O que mais estudar sobre o tema

• A estrutura tridimensional e as propriedades das cadeias de polissacarídeos de dextrana.
• A natureza química das resinas de troca iônica insolúveis.
• Os mecanismos de fixação covalente do ligante a um polímero inerte.
• A natureza da ligação complementar entre a proteína e o ligante.

Outros tópicos da seção "Estrutura, propriedades e funções das proteínas"

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