Radioimmunoassay (RIA)
O método radioimune baseia-se na reação altamente sensível de ligação do antígeno ao anticorpo. O papel do marcador indicador aqui é desempenhado por radionuclídeos — mais frequentemente são utilizados isótopos de iodo, carbono ou trítio.
Tecnicamente, o processo de pesquisa resume-se à separação do complexo imune radioativo formado e à subsequente medição do nível de radiação beta ou gama com a ajuda de um contador especial. A intensidade da radiação registrada está em dependência matemática direta do número de moléculas ligadas.
Existem duas variantes principais para a realização da reação:
- RIA em fase sólida. Um dos componentes reagentes (antígeno ou anticorpo) é previamente sorvido em um suporte sólido, por exemplo, nos poços de uma placa de poliestireno.
- RIA competitivo. Utilizado para contagem quantitativa precisa. O antígeno de interesse da amostra do paciente e o antígeno marcado padrão adicionado competem por um pool limitado de anticorpos.
O método possui sensibilidade colossal, capturando concentrações minoritárias de substâncias, mas apresenta um certo perigo ambiental devido à necessidade de trabalhar com fontes de radiação. Com sua ajuda, os laboratórios determinam os níveis de hormônios, enzimas, medicamentos, imunoglobulinas e antígenos microbianos.
Imunoblotting (Western blot)
O imunoblotting, também conhecido como Western Blot, representa uma abordagem diagnóstica complexa que combina as capacidades da eletroforese, transferência de frações e ensaio imunoenzimático (ou radioimune). É uma ferramenta indispensável para o diagnóstico confirmatório, cujo exemplo clássico é a verificação da infecção pelo HIV.
A pesquisa ocorre em três etapas sequenciais:
- Eletroforese. Os antígenos do patógeno são separados em gel de poliacrilamida sob a influência de corrente elétrica. As frações distribuem-se estritamente de acordo com sua massa molecular e carga.
- Blotting (transferência). Os antígenos separados são replicados do gel para uma membrana de nitrocelulose. Ao mesmo tempo, a disposição topográfica exata das bandas invisíveis (blots) é preservada.
- Revelação. Na etapa diagnóstica, são utilizadas tiras comerciais prontas (strips) com os blots aplicados. O soro do paciente em estudo é aplicado nelas. Se anticorpos específicos estiverem presentes no sangue, eles se ligam aos antígenos. Após a lavagem dos elementos não ligados, são adicionados anticorpos secundários anti-espécie (contra imunoglobulinas humanas) portadores de um marcador enzimático. A adição de cromógeno causa uma mudança na coloração do substrato, e bandas nítidas são visualizadas na membrana.
Microscopia eletrônica imune
Este método combina elegantemente o poder de resolução da microscopia eletrônica com a especificidade das reações sorológicas. O principal objetivo do método é o estudo visual detalhado de microrganismos, predominantemente vírus.
Durante o tratamento de partículas virais com soro imune específico, ocorre a formação de grandes agregados imunes. Os anticorpos cercam densamente os vírions, criando ao redor deles uma espécie de «coroa» proteica. Esta camada fornece um contraste eletro-óptico acentuado, graças ao qual as partículas virais e seus aglomerados tornam-se claramente visíveis.
Para o reforço adicional da visibilidade, aplica-se a marcação com marcadores eletro-densos. Em particular, os anticorpos são conjugados com ferritina — uma proteína especial contendo ferro, que retém excelentemente o feixe de elétrons e ajuda a localizar os antígenos de interesse.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo é um método instrumental para análise de populações celulares, diferenciação de células sanguíneas e sua identificação por antígenos CD de superfície.
Antes do início da análise, a suspensão celular é corada especificamente com anticorpos monoclonais previamente marcados com fluoróforos. No próprio citômetro, é implementado o princípio da focalização hidrodinâmica: as células alinham-se em uma única fila no capilar e cruzam a zona de irradiação a laser estritamente uma a uma.
O laser executa duas tarefas principais:
- Avaliação da morfologia. O detector de dispersão de luz frontal registra o tamanho e a granularidad interna da célula que passa.
- Avaliação de marcadores. O laser excita a emissão dos marcadores fluorofóricos acoplados. A intensidade da fluorescência reflete a densidade dos antígenos CD na membrana.
O complexo sistema óptico do aparelho utiliza espelhos dicróicos para separar a luz emitida por comprimentos de onda (por exemplo, espectro verde de 530–550 nm e vermelho de 560–580 nm). O sinal direcionado aos fotomultiplicadores é convertido em um histograma gráfico.
| Direção do diagnóstico | O que é avaliado especificamente pelo método |
|---|---|
| Perfil celular | Teor quantitativo de populações de linfócitos |
| Atividade funcional | Fagocitose e atividade de células NK (natural killers) |
| Status citosínico | Nível de produção de várias citocinas |
| Viabilidade | Características da morte celular (apoptose, piroptose) |
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Que tipos de radiação são registrados pelo contador durante a separação do complexo imune radioativo no RIA?
Durante a separação do complexo imune radioativo no radioimmunoassay, radiação $\beta$- ou $\gamma$- é registrada pelo contador. Para a marcação de antígenos ou anticorpos neste método, são utilizados radionuclídeos, tais como os isótopos $^{125}\text{I}$, $^{14}\text{C}$ e $^3\text{H}$. A intensidade da radiação registrada é diretamente proporcional ao número de moléculas ligadas. O método distingue-se por uma sensibilidade extremamente alta e permite detectar concentrações minoritárias de substâncias (hormônios, enzimas, antígenos de micróbios), mas apresenta perigo ambiental devido à necessidade de trabalhar com radiação.
Quais espelhos dicróicos específicos são utilizados para separar a luz emitida por comprimentos de onda na citometria de fluxo?
Na citometria de fluxo, são utilizados divisores de feixe (espelhos dicróicos) que separam a luz emitida por comprimento de onda. As fontes não indicam marcas ou tipos específicos de espelhos, no entanto, observa-se que eles direcionam a luz para os fotodetectores correspondentes, destacando espectros específicos:
- Espectro verde — comprimento de onda de 530–550 nm.
- Espectro vermelho — comprimento de onda de 560–580 nm.
A separação ocorre após o feixe de laser excitar a emissão de fluoróforos na superfície das células que passam através de um capilar fino.
Quais enzimas específicas são usadas para obter o marcador enzimático em anticorpos secundários anti-espécie durante o blotting?
As fontes não indicam as enzimas específicas utilizadas na composição de anticorpos secundários anti-espécie no imunoblotting. Apenas é indicado que estes anticorpos são marcados com uma enzima e, após a sua aplicação, é adicionado um substrato ou cromógeno, causando a coloração das bandas.
O que mais estudar sobre o tema
- Mecanismos de apoptose e piroptose avaliados na citometria de fluxo
- O espectro de antígenos CD e seu papel na identificação de linfócitos
- Bandas proteicas específicas (blots) importantes no diagnóstico da infecção pelo HIV
- Princípios físicos de funcionamento de fotomultiplicadores na citofluorometria a laser
- Isótopos utilizados no radioimmunoassay e sua segurança fisiológica
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