Princípio geral e mecanismo da reação
No ensaio imunoenzimático (ELISA), um papel fundamental é desempenhado pelo conjugado, que consiste em anticorpos aos quais uma enzima foi quimicamente acoplada. Mais frequentemente, utilizam-se como marcadores a peroxidase de rábano, a $\beta$-galactosidase ou a fosfatase alcalina.
A reação ocorre em várias etapas:
- Formação do complexo imune antígeno-anticorpo.
- Adição de um substrato ou cromógeno especial.
- A enzima presente no conjugado cliva o substrato.
- Como resultado da clivagem, a cor da solução se altera.
A intensidade da coloração desenvolvida depende diretamente do número de moléculas ligadas. Isso permite a avaliação quantitativa da substância analisada. Para interromper a reação no momento desejado, adiciona-se ácido à mistura, o que desnatura a enzima.
ELISA em fase sólida
O mais difundido é o ELISA em fase sólida (ELISA). Sua principal característica é que um dos componentes (antígeno ou anticorpo) é previamente fixado (sorvido) em um suporte sólido. Geralmente, o papel do suporte é desempenhado pelos poços de placas de poliestireno.
Uma condição fundamental para a realização bem-sucedida do ELISA em fase sólida é a lavagem minuciosa dos poços da placa após cada adição de um novo reagente. Isso é necessário para a remoção completa de todas as moléculas não ligadas, a fim de evitar o surgimento de resultados falso-positivos.
Principais variantes do ELISA
Dependendo dos objetivos diagnósticos, diferentes esquemas de análise são aplicados:
- Detecção de anticorpos (sorodiagnóstico): O objetivo é encontrar imunoglobulinas específicas contra o patógeno no soro do paciente. Um antígeno conhecido é fixado no fundo do poço. Ao adicionar o soro do paciente, seus anticorpos (se presentes) ligam-se ao antígeno. Em seguida, adiciona-se o conjugado (soro antiglobulina com enzima), que se fixa aos fragmentos Fc dos anticorpos do paciente. A adição do substrato causa coloração.
- Detecção de antígenos («método sanduíche»): Utilizado para procurar o próprio patógeno ou suas partículas. Anticorpos diagnósticos são fixados no poço. Eles «capturam» o antígeno de interesse do soro do paciente. Depois disso, adicionam-se anticorpos marcados contra o mesmo antígeno, que fecham o complexo («sanduíche»). A presença da enzima é confirmada por uma reação colorimétrica.
- ELISA competitivo: O método baseia-se na competição de moléculas por um número limitado de locais de ligação. Por exemplo, ao procurar um antígeno, o antígeno de interesse do paciente e o antígeno padrão marcado adicionado competem pela ligação aos anticorpos.
Aplicação na prática clínica
Devido à sua altíssima sensibilidade (detecção de concentrações de até $10^{-10}$ — $10^{-12}$ g/L), o ELISA é amplamente utilizado na medicina moderna.
Principais áreas de uso:
- Diagnóstico de doenças infecciosas: virais (incluindo hepatite B e HIV), bacterianas, parasitárias.
- Determinação quantitativa de moléculas biologicamente ativas, como hormônios e enzimas.
- Monitoramento da concentração de medicamentos no organismo.
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Quais classes de anticorpos (imunoglobulinas) são determinadas de forma diferencial pelo método ELISA para avaliar o estágio do processo infeccioso?
O método ELISA determina diferencialmente as imunoglobulinas das classes M e G.
- Imunoglobulinas da classe M (IgM) — marcador de infecção recente; na infecção por herpesvírus, um aumento de 4 vezes ou mais no título de IgM indica infecção primária.
- Imunoglobulinas da classe G (IgG) — na infecção por herpesvírus, a elevação do título indica uma forma recidivante da doença; na infecção por rotavírus, a imunidade pós-infecção é conferida por anticorpos da classe IgG.
Para lembrar a essência do método sanduíche, imagine um sanduíche: a fatia de pão inferior são os anticorpos fixados no fundo do poço, o recheio (carne) é o antígeno de interesse do sangue do paciente, e a fatia de pão superior são os anticorpos marcados adicionados que fecham a estrutura.
Questões de aulas e exames
O que é um conjugado no ELISA?
O conjugado são anticorpos firmemente ligados (conjugados) a uma molécula de enzima, que serve como marcador para a posterior visualização da reação.
Qual é a diferença entre o método de detecção direto e indireto?
O esquema de busca de anticorpos no soro (sorodiagnóstico) é um método indireto, pois o marcador enzimático está localizado nos anticorpos secundários (antiglobulina), enquanto o método sanduíche visa à busca de antígenos.
O que mais estudar sobre o tema
- Mecanismo detalhado de ação da peroxidase de rábano
- Causas de resultados falso-positivos e falso-negativos no ELISA
- Espectrofotometria: como os aparelhos leem a intensidade da coloração
- Particularidades do ELISA no diagnóstico da infecção pelo HIV
- Comparação entre ELISA e o diagnóstico por PCR
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