Fatores de solubilidade e carga elétrica
A capacidade das proteínas de se dissolverem em água depende tanto de suas próprias características (relação de radicais polares e apolares, resistência à desnaturação) quanto dos parâmetros do meio: temperatura, composição salina, presença de substâncias orgânicas e índice de acidez (pH).
A carga líquida da molécula desempenha um papel fundamental. Ela é formada devido aos grupos ionizados de aminoácidos — grupos carboxila negativos e grupos amino positivos. Uma alteração no pH do meio desloca esse equilíbrio:
- Em meio ácido (com excesso de prótons de hidrogênio), a dissociação dos grupos carboxila é suprimida. A proteína perde cargas negativas e torna-se mais positiva.
- Em meio alcalino (com excesso de íons hidroxila), os prótons se dissociam dos grupos amino, tornando-os neutros. Como resultado, a proteína perde a carga positiva e torna-se mais negativa.
Ponto isoelétrico (PI)
Existe um valor específico de pH no qual o número de grupos positivamente e negativamente carregados na molécula de proteína se iguala. Esse estado é chamado de ponto isoelétrico.
No estado isoelétrico, a carga líquida da proteína é igual a zero. Como resultado, as forças de repulsão eletrostática entre as moléculas desaparecem, elas começam a aderir umas às outras (agregar) e precipitam. É exatamente no PI que a solubilidade da proteína é mínima.
Um exemplo marcante desse processo é a coalhada do leite. No leite fresco, as moléculas da proteína caseína estão carregadas negativamente e formam uma solução coloidal estável. Com a proliferação bacteriana, ácido lático é liberado, o que reduz o pH. Quando a acidez atinge o ponto isoelétrico da caseína (cerca de 4,6), sua carga é neutralizada, as moléculas param de se repelir e o leite coalha.
Princípios de isolamento e purificação de proteínas
Para estudar as propriedades de uma proteína específica, ela deve ser extraída das células e purificada. O algoritmo padrão inclui várias etapas:
- Ruptura celular para obter um homogenato.
- Fracionamento (centrifugação) — separação da mistura em frações nuclear, mitocondrial, citossólica e outras, para isolar aquela onde se encontra a proteína de interesse.
- Desnaturação térmica seletiva — aquecimento breve. Se a proteína desejada for termoestável, o aquecimento fará com que as impurezas termolábeis se desnaturem e precipitem, deixando a proteína alvo em solução.
- Salting-out (salinização) — adição de sais (mais frequentemente sulfato de amônio). As proteínas com menor solubilidade precipitam em baixas concentrações de sal. Aumentando gradualmente a concentração, é possível separar a mistura em frações individuais.
Separação de proteínas por massa
Para separar macromoléculas com base em seu tamanho e peso, utilizam-se ultracentrifugação, eletroforese em gel de poliacrilamida e gel-filtração (cromatografia de exclusão molecular).
O princípio da gel-filtração baseia-se na passagem da mistura através de uma coluna com grânulos porosos. As proteínas grandes não conseguem penetrar fisicamente nos poros do gel; elas passam pelo espaço livre entre os grânulos e são eluídas da coluna primeiro. As moléculas pequenas penetram no interior dos poros, seu caminho é muito prolongado, por isso deixam a coluna por último.
Outro método importante é a eletroforese em papel, que separa proteínas em um campo elétrico. No soro sanguíneo de um indivíduo saudável, as albuminas movem-se mais rapidamente em direção ao ânodo (a maior fração, 54–58%). São seguidas pelas globulinas (alfa-1, alfa-2 e beta). As gamma-globulinas possuem a menor mobilidade, formando a fração catódica.
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Quais sais, além do sulfato de amônio, são usados para a precipitação de proteínas?
Para a precipitação de proteínas, além do sulfato de amônio, utilizam-se sulfato de sódio e cloreto de sódio.
O salting-out é a precipitação reversível de uma proteína a partir de uma solução usando altas concentrações de sais neutros. Os íons de sal são hidratados, retirando água das moléculas de proteína e neutralizando sua carga, o que leva à agregação e precipitação das proteínas.
Com quais reagentes químicos é realizada a precipitação irreversível de proteínas?
A precipitação irreversível (desnaturação) de proteínas é realizada com os seguintes reagentes químicos:
- Ácidos e álcalis — alteram a ionização dos grupos ionogênicos, rompendo ligações iônicas e de hidrogênio.
- Solventes orgânicos (álcool, fenol, cloramina) — destroem interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio.
- Sais de metais pesados — formam sais insolúveis de proteínas.
- Ureia — destrói ligações de hidrogênio intramoleculares.
- Detergentes.
A क्या se devem as propriedades tampão das soluções de proteínas?
As propriedades tampão das soluções de proteínas devem-se à presença em suas moléculas de grupos amino e carboxila, que podem atuar como ácidos e bases.
A composição do sistema tampão proteico inclui a molécula de proteína (NH₂-Prot-COOH) e seu sal (NH₂-Prot-COONa). Quando o ácido entra, a proteína liga prótons e, quando a base entra, doa prótons, mantendo assim o pH do meio. A capacidade tampão das proteínas em relação ao ácido é maior do que em relação aos álcalis.
Quais tipos de ligações químicas são rompidas durante a desnaturação térmica da proteína?
Durante a desnaturação térmica da proteína, rompem-se as ligações fracos que estabilizam sua estrutura terciária e secundária.
Essas ligações incluem:
- Pontes de hidrogênio.
- Interações hidrofóbicas.
- Ligações iônicas.
A ruptura dessas ligações ocorre devido ao aumento do movimento caótico das moléculas em altas temperaturas (acima de 60 °C), enquanto as ligações peptídicas (estrutura primária) são preservadas.
Para não confundir os resultados da gel-filtração, imagine que os grânulos do gel são casas com portas estreitas. Moléculas "gordas" (grandes) não conseguem entrar na casa, por isso correm rapidamente pela rua e chegam à linha de chegada primeiro. Moléculas "magras" (pequenas) entram em cada porta, vagam pelos cômodos por muito tempo e chegam por último.
Questões de aulas e exames
Por que a proteína desnaturada precipita mais facilmente?
Durante a desnaturação, a estrutura espacial da molécula é rompida e os radicais hidrofóbicos de aminoácidos, que normalmente estão escondidos no interior, ficam na superfície. Isso diminui drasticamente a solubilidade da proteína em água.
Qual valor de pH deve ser criado para que um peptídeo com carga de -1 atinja o ponto isoelétrico?
Como a carga do peptídeo é negativa, ela precisa ser neutralizada adicionando prótons (cargas positivas). Para isso, o meio deve ser acidificado, ou seja, o PI estará em meio ácido (pH < 7).
O que acontecerá com a carga da proteína ao adicionar álcali?
Em meio alcalino, há um excesso de íons hidróxido. Eles se ligam a prótons, retirando-os dos grupos amino. Como resultado, a carga positiva da proteína diminui e ela se torna mais negativa.
O que mais estudar sobre o tema
- Regras para o cálculo da carga líquida de um peptídeo com base nos resíduos de aminoácidos
- Proteinograma de um indivíduo saudável: proporção percentual das frações
- Princípios da eletroforese em gel de poliacrilamida (na presença de SDS)
- Mecanismos moleculares do salting-out reversível de proteínas
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