Objectifs et modèles de culture
La culture d'agents viraux constitue une étape clé dans la transition vers les méthodes de diagnostic de laboratoire. L'amplification des virus est nécessaire pour répondre à trois objectifs fondamentaux :
- Diagnostic de laboratoire des maladies infectieuses chez les patients.
- Objectifs scientifiques, comprenant l'étude détaillée de la pathogenèse des infections et des mécanismes d'immunité.
- Objectifs de production, visant l'obtention de préparations diagnostiques spécifiques et de vaccins.
Pour réussir la culture des virus en virologie moderne, on utilise trois modèles biologiques principaux (milieux de culture) :
- Animaux de laboratoire (in vivo).
- Embryons d'oiseaux en développement (le plus souvent de poulet).
- Cultures cellulaires ou tissulaires (in vitro).
Étapes de l'analyse des virus cultivés
Lors de la manipulation de cultures virales, il existe une distinction méthodologique importante entre la détection de l'agent pathogène et sa reconnaissance précise. Ce processus se divise strictement en deux étapes consécutives.
Indication du virus L'indication consiste à détecter le fait même de la réplication (multiplication) du virus dans le modèle biologique fourni. La méthode repose sur la mise en évidence des propriétés biologiques de l'agent pathogène et des particularités de son interaction avec les cellules vivantes (par exemple, l'enregistrement de l'effet cytopathique exercé par le virus sur la cellule infectée).
Identification du virus L'identification consiste à déterminer précisément l'appartenance taxonomique du virus détecté (son espèce et son type). Cette étape est réalisée au moyen de réactions immunologiques, fondées sur l'interaction spécifique entre les antigènes du virus cultivé et des anticorps de laboratoire préétablis.
Culture dans l'organisme d'animaux de laboratoire
Il s'agit historiquement du premier modèle biologique (in vivo). Les souris blanches adultes ou nouveau-nés sont le plus souvent utilisées comme sujets d'inoculation. Des hamsters, des cobayes, des lapins, des singes et d'autres animaux peuvent également être employés.
Particularités d'inoculation et d'indication Les voies d'inoculation chez l'animal dépendent strictement du tropisme viral, c'est-à-dire de son affinité naturelle pour certains tissus de l'organisme. En fonction de cela, les voies d'administration sont choisies : sous-cutanée, intramusculaire, intranasale ou intracrânienne (directement dans le cerveau).
L'indication de la réplication (évaluation des résultats) s'effectue selon les critères suivants :
- Apparition de symptômes cliniques visibles de la maladie chez l'animal.
- Altérations pathomorphologiques des tissus et des organes révélées lors de l'autopsie.
- Réalisation de la réaction d'hémagglutination (RHA). Elle est effectuée avec une suspension préparée à partir des organes de l'animal infecté et permet d'identifier les virus capables de agglutiner les érythrocytes.
Limites de la méthode Actuellement, ce modèle est rarement utilisé. Les principales raisons en sont la résistance spécifique prononcée des animaux à de nombreux virus humains, le risque élevé de contamination (souillure) de l'expérience par des microbes étrangers, le coût économique important lié à l'entretien de l'animalerie et d'importantes considérations éthiques.
Culture dans des embryons de poulet
Cette méthode est historiquement importante et reste largement utilisée dans l'industrie, malgré certaines limites. Des embryons de poulet en développement âgés de 5 à 12 jours sont utilisés comme supports.
Technique de travail et spectre viral La technique d'inoculation implique l'introduction du matériel à étudier dans différentes cavités de l'embryon (allantoïdienne ou amniotique), ou directement dans ses tissus. Cette méthode s'avère particulièrement efficace pour la culture des virus de la grippe, de l'herpes, de la variole et de divers autres agents pathogènes.
Avantages et inconvénients Les avantages indéniables du modèle incluent :
- La possibilité d'accumuler une biomasse virale en très grandes quantités.
- L'absence totale d'infections virales cachées (latentes) chez l'embryon lui-même, ce qui rend le milieu « propre ».
- Une haute accessibilité économique et une mise en œuvre simple pour tout laboratoire.
Le principal inconvénient de la méthode réside dans le fait que de nombreux virus sont physiologiquement incapables de se multiplier dans les tissus d'embryons d'oiseaux.
Comment savoir si le virus s'est multiplié (Indication) ? La réplication virale dans l'embryon est attestée par la mort de ce dernier, l'apparition de lésions spécifiques sur son corps ou ses membranes (pustules, hémorragies locales), ainsi que par une réaction d'hémagglutination (RHA) positive réalisée avec le liquide extrait des cavités de l'embryon infecté.
En bref : réponses aux questions sur le sujet
Quels types de cultures cellulaires utilise-t-on pour la culture de virus in vitro ?
Pour cultiver des virus in vitro, on emploie plusieurs types de cultures cellulaires.
- Cultures primaires — cultures de cellules tissulaires humaines.
- Cultures continues (lignées cellulaires continues) — cultures de cellules tissulaires humaines.
- Fibroblastes diploïdes — fibroblastes humains nécessitant une incubation prolongée.
- Cultures de cellules d'embryon de porc — utilisées pour l'isolement de certains virus (par exemple, les flavivirus).
- Cultures de cellules à croissance rapide — employées dans la méthode virologique pour isoler des virus à ADN.
Quelles réactions immunologiques spécifiques utilise-t-on pour l'identification des virus ?
Pour identifier les virus, on utilise des réactions immunologiques basées sur l'interaction entre les antigènes viraux et des anticorps connus.
- RN — réaction de neutralisation (en culture cellulaire ou chez la souris, à l'aide de sérums typospécifiques).
- RIF — réaction d'immunofluorescence.
- ELISA — dosage immuno-enzymatique.
- RFC — réaction de fixation du complément.
- RTHA — réaction d'inhibition de l'hémagglutination (par exemple, avec des érythrocytes d'oie).
- RPHA — réaction d'hémagglutination passive.
Quelles méthodes d'indication virale applique-t-on dans les cultures cellulaires, en dehors de l'évaluation de l'effet cytopathique ?
Outre l'évaluation de l'effet cytopathique, les méthodes suivantes sont appliquées pour l'indication virale dans les cultures cellulaires :
- Formation d'inclusions intracellulaires — mise en évidence d'amas de particules virales ou de leurs composants ; les inclusions peuvent être intranucléaires ou cytoplasmiques péri-nucléaires.
- Phénomène de formation de plages (plaques) — détection de colonies virales négatives (zones « stériles » dans la couche cellulaire sous une couverture d'agar).
- Réactions d'hémadsorption et d'hémagglutination — mise en évidence de l'interaction du virus avec les érythrocytes ; lors de l'hémadsorption, les érythrocytes adhèrent aux cellules infectées.
- Réaction « colorée » (épreuve colorimétrique) — enregistrement du changement de pH du milieu.
Pour mémoriser les étapes de manipulation d'un virus, servez-vous de cette association : « D'abord, le voyant s'allume (Indication : le virus est-il présent ?), puis nous consultons la carte d'identité (Identification : de quel virus s'agit-il exactement ?). »
À étudier également sur le sujet
- Effet cytopathique (ECP) des virus sur les cellules
- Mécanisme de la réaction d'hémagglutination (RHA)
- Réactions immunologiques pour l'identification des viral
- Tropisme viral : mécanismes d'affinité tissulaire
- Cultures cellulaires (in vitro) comme troisième modèle de culture
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