Cromatografía de proteínas

Gel-filtración: separación por masa molecular

Este método se basa en el efecto de tamiz molecular. La esencia del proceso consiste en tamizar las moléculas de proteínas a través de un soporte especializado: perlas tumefactas de sefadex.

El sefadex en sí mismo es una estructura espacial compleja. Son cadenas tridimensionales de polisacáridos de dextrano dentro de las cuales se forman poros de un diámetro determinado. Al pasar la mezcla a través de la columna, la velocidad de avance de las diferentes proteínas depende directamente de su masa molecular.

La separación se produce según el siguiente principio:

• Las moléculas de menor masa penetran libremente en el espacio interno de los poros de las perlas de sefadex. Debido a esto, su trayectoria se alarga, se retardan en la columna y salen de ella mucho más tarde.
• Las moléculas de gran masa, por el contrario, no son físicamente capaces de entrar en los poros del dextrano. Rodean las perlas por el exterior y, por lo tanto, eluyen (se lavan) más rápidamente de la columna cromatográfica.

Cromatografía de intercambio iónico: el papel de la carga eléctrica

Este tipo de fraccionamiento se basa en la interacción electrostática. El proceso tiene lugar mediante la unión de los grupos ionizados de las propias proteínas con los grupos funcionales del soporte cargados opuestamente. Dichos soportes actúan como resinas de intercambio iónico, materiales poliméricos insolubles especiales.

La regla clave del método: la fuerza de adsorción (unión de la proteína a la resina) es estrictamente proporcional a la magnitud de la carga eléctrica de la molécula de proteína. Cuanto más cargada esté la proteína, más firmemente se fija al polímero.

Para extraer la proteína aislada de la columna, se aplica el procedimiento de elución (lavado). Las proteínas adsorbidas se lavan utilizando soluciones de cloruro de sodio (NaCl). La concentración de sal se aumenta gradualmente durante este proceso. La regularidad de la elución es tal que cuanto menor es la carga de una proteína específica, menor es la concentración de NaCl necesaria para romper su unión con los grupos ionógenos de la resina y lavarla hacia el tubo de ensayo.

Cromatografía de afinidad: especificidad absoluta

Entre todos los enfoques considerados, la cromatografía de afinidad destaca como el método más específico para aislar proteínas individuales. Permite «pescar» de forma dirigida la macromolécula deseada a partir de mezclas muy complejas.

El mecanismo de este método incluye varias etapas sucesivas:

1. Preparación del soporte: un ligando —una molécula con la que la proteína de interés interactúa en condiciones naturales— se une firmemente a un polímero químicamente inerte mediante enlace covalente.
2. Aplicación de la mezcla: la solución de proteínas se aplica a la columna. En este momento, se produce una unión complementaria estricta de la proteína deseada con el ligando inmovilizado.
3. Resultado final: en la columna polimérica se adsorbe exclusivamente aquella proteína que es específica para este ligando en particular. Todas las demás proteínas (balasto) pasan a través de ella sin obstáculos, sin ser retenidas.

Preguntas de clases y exámenes

Qué más repasar sobre el tema

• Estructura tridimensional y propiedades de las cadenas de polisacáridos de dextrano.
• Naturaleza química de las resinas de intercambio iónico insolubles.
• Mecanismos de unión covalente del ligando a un polímero inerte.
• Naturaleza de la unión complementaria entre la proteína y el ligando.

Otros temas de la sección «Estructura, propiedades y funciones de las proteínas»

Material preparado por los profesores de WhiteCoat Pro según el plan de estudios de las facultades de medicina. De carácter educativo.