Base físico-química del método
El fundamento del método de hibridación molecular es una propiedad físico-química única de la molécula de ADN. Es capaz de sufrir cambios estructurales reversibles en respuesta a las fluctuaciones de temperatura del entorno.
Procesos clave que ocurren en el ADN:
- Desnaturalización. Es el proceso de separación de las cadenas. Se desencadena al calentar el medio a $90^\circ\text{C}$, y la reacción debe llevarse a cabo necesariamente en condiciones alcalinas. Como resultado, la estructura bicatenaria se disocia en hebras individuales.
- Renaturalización. Es el proceso de restauración de la doble hélice original. Para que las hebras vuelvan a unirse, es necesario disminuir la temperatura en $10^\circ\text{C}$ respecto al nivel de desnaturalización.
Precisamente esta capacidad de separación y posterior unión de regiones complementarias permite a los investigadores «aparear» artificialmente hebras de diferentes fuentes para evaluar su similitud.
La sonda de ADN como patrón de comparación
Para encontrar una secuencia específica en la muestra analizada, se utiliza una herramienta especial: la sonda.
La sonda es una molécula de ácido nucleico monocatenario. Para poder detectar la hibridación mediante instrumentos, esta molécula patrón se marca previamente con marcadores especiales; en la variante clásica, para ello se utilizan nucleótidos radiactivos.
Durante el análisis, la sonda cumple la función de un patrón estricto: interactúa únicamente con aquellas regiones del ADN analizado que poseen un alto grado de homología (complementariedad) con respecto a ella.
Algoritmo para realizar la reacción clásica
El procedimiento de hibridación molecular clásica consta de varios pasos consecutivos, cada uno de los cuales es críticamente importante para obtener un resultado fiable:
- Preparación de la muestra. El ADN del microorganismo analizado se somete a desnaturalización térmica para separar la molécula bicatenaria en hebras individuales.
- Fijación. Una de las hebras obtenidas del ADN analizado se fija firmemente en la superficie de un filtro especial.
- Hibridación. El filtro preparado con la hebra fijada se sumerge en una solución que contiene la sonda marcada radiactivamente.
- Evaluación del resultado. Se considera un resultado positivo la formación de una doble hélice híbrida. Esto ocurre solo si existe complementariedad entre el ADN del microbio y la sonda patrón.
Tecnología de microarrays
Una modificación moderna y de alto rendimiento de la hibridación molecular es la tecnología de microarrays. El principio de funcionamiento de dicho chip se basa en el uso de una placa de vidrio (matriz). En esta placa, en loci estrictamente definidos, se fijan sondas de ADN. Un microchip puede contener de 100 a 1000 tipos de sondas, cada una de las cuales es específica para una unidad taxonómica microbiana concreta.
Etapas del análisis en microarray:
- Extracción. Se extrae la masa total de ADN de la muestra clínica o de laboratorio proporcionada.
- Amplificación. Se lleva a cabo la multiplicación de una secuencia genética estable. Por regla general, el blanco es el gen del ARNr 16S.
- Marcaje. El ADN obtenido en la etapa anterior se marca. A diferencia del método clásico, aquí se suele utilizar un fluoróforo o una enzima específica.
- Hibridación. Procesamiento directo de la superficie del microarray con el ADN marcado preparado.
- Lavado. Eliminación minuciosa de todo el ADN que no se haya unido a las sondas de la matriz.
- Detección. Determinación de la localización de los híbridos formados. Se visualizan como puntos fluorescentes. La lectura se realiza mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) o densitometría. La localización de la fluorescencia permite identificar con precisión la especie microbiana.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué métodos de hibridación en soporte sólido existen?
Como soportes sólidos para la hibridación molecular, las fuentes describen el filtro y la matriz de vidrio.
Métodos y tecnologías disponibles:
- Hibridación en filtro: una de las hebras de ADN desnaturalizado en estudio se fija en un filtro especial, tras lo cual el filtro se sumerge en una solución con una sonda radiactiva. Si existe complementariedad entre la sonda y el ADN microbiano, se forma una doble hélice híbrida.
- Tecnología de micromatrices (microarrays): se basa en el método de hibridación molecular; consiste en una placa de vidrio (matriz) en cuyos Loci específicos se fijan sondas de ADN características de determinadas unidades taxonómicas.
¿En qué consiste el método de hibridación fluorescente in situ (FISH)?
La esencia del método de hibridación fluorescente in situ (FISH), según las fuentes proporcionadas, se describe como un estudio molecular citogenético que utiliza una sonda de ADN.
El método se aplica para los siguientes fines:
- Determinación de la amplificación génica, por ejemplo, la amplificación del gen HER2 mediante el método FISH; también se indica la determinación de la amplificación del gen ERBB2 (HER2/Neu) en material de biopsia o quirúrgico mediante el método FISH.
- Estudio citogenético: método FISH para un par de cromosomas.
Las fuentes indican que la técnica FISH se realiza utilizando una sonda de ADN y se lleva a cabo tras un tratamiento hipotónico de las células, sobre una suspensión celular preparada, así como en improntas y frotis.
Para memorizar el régimen térmico de trabajo con el ADN, utilice la regla «90 menos 10»: a 90°C en medio alcalino el ADN se desenrolla (desnaturalización), y al disminuir 10°C se vuelve a ensamblar (renaturalización).
Preguntas de clases y exámenes
¿Qué es una sonda de ADN y para qué sirve?
Es una molécula de ácido nucleico monocatenaria, marcada con nucleidos radiactivos. Se utiliza como estándar para la búsqueda de regiones homólogas en el ADN en estudio.
¿Cómo se evalúa un resultado positivo de hibridación?
Un resultado positivo se registra cuando se forma una doble hélice híbrida entre la sonda y la hebra de ADN analizada gracias a su complementariedad.
¿Qué gen se amplifica con mayor frecuencia en el análisis por micromatrices?
Por lo general, para la amplificación y el análisis posterior se selecciona una secuencia estable: el gen de ARNr 16S.
¿Con qué se marca el ADN al utilizar la tecnología de micromatrices?
En la tecnología de micromatrices, el ADN amplificado se marca con un fluoróforo o una enzima, lo que permite detectar los híbridos en forma de puntos fluorescentes.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismos de desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos
- Principios del marcaje radioisotópico de sondas de ADN
- El papel del gen de ARNr 16S en la taxonomía y la identificación bacteriana
- Uso de la densitometría y el ELISA para la detección de resultados en micromatrices
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