Tarefas e modelos de cultura
A cultura de agentes virais é uma etapa fundamental na transição para os métodos de diagnóstico laboratorial. A propagação de vírus é necessária para resolver três tarefas fundamentais:
- Diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas em pacientes.
- Objetivos científicos, incluindo o estudo detalhado da patogênese das infecções e dos mecanismos de formação da imunidade.
- Tarefas de produção, voltadas para a obtenção de preparados diagnósticos específicos e vacinas.
Para o cultivo bem-sucedido de vírus na virologia moderna, utilizam-se três modelos biológicos principais (meios de cultura):
- Animais de laboratório (in vivo).
- Embriões de aves em desenvolvimento (mais frequentemente utilizados são os de galinha).
- Culturas de células ou tecidos (in vitro).
Etapas de análise dos vírus cultivados
Ao trabalhar com culturas virais, existe uma importante distinção metodológica entre a detecção do patógeno e o seu reconhecimento preciso. Esse processo divide-se estritamente em duas etapas consecutivas.
Indicação do vírus A essência da indicação consiste na detecção do próprio fato da reprodução (multiplicação) do vírus no modelo biológico fornecido. O método baseia-se na identificação das propriedades biológicas do patógeno e das características de sua interação com células vivas (por exemplo, o registro do efeito citopático que o vírus exerce sobre a célula infectada).
Identificação do vírus A essência da identificação é a determinação precisa da pertença taxonômica do vírus detectado (sua espécie e tipo). Esta etapa é realizada por meio de reações imunológicas. Elas baseiam-se na interação específica entre os antígenos do vírus cultivado e anticorpos de laboratório previamente conhecidos.
Cultura em organismos de animais de laboratório
Este é historicamente o primeiro modelo biológico (in vivo). Os objetos de infecção mais frequentes são camundongos albinos adultos ou recém-nascidos. Hamsters, coelhos, macacos e outros animais também podem ser utilizados.
Características de infecção e indicação Os métodos de infecção de animais dependem estritamente do tropismo viral — sua afinidade natural por determinados tecidos do organismo. Dependendo disso, escolhem-se as vias de administração do material: subcutânea, intramuscular, intranasal ou intracraniana (diretamente no cérebro).
A indicação da reprodução (avaliação dos resultados) é realizada de acordo com os seguintes critérios:
- Surgimento de sintomas clínicos visíveis da doença no animal.
- Alterações patomorfológicas nos tecidos e órgãos detectadas na autópsia.
- Realização da reação de hemoaglutinação (RHA). Ela é realizada com uma suspensão preparada a partir dos órgãos do animal infectado e permite identificar vírus com a capacidade de aglutinar eritrócitos.
Limitações do método Atualmente, este modelo é raramente utilizado. As principais razões são: a pronunciada suscetibilidade interespecífica (resistência) dos animais a muitos vírus humanos, o alto risco de contaminação do experimento por micróbios estranhos, custos econômicos significativos para a manutenção do biotério e considerações éticas sérias.
Cultura em embriões de galinha
Este método é historicamente significativo e ainda é amplamente utilizado na indústria, apesar de certas limitações. O objeto utilizado são embriões de galinha em desenvolvimento com idade entre 5 e 12 dias.
Técnica de trabalho e espectro de vírus A técnica de infecção envolve a introdução do material em estudo em várias cavidades do embrião (alantoica ou amniótica) ou diretamente em seus tecidos. Este método possui alta eficácia para o cultivo de vírus da gripe, herpes, varíola e vários outros patógenos.
Vantagens e desvantagens As vantagens inegáveis do modelo incluem:
- Capacidade de acumular massa viral em quantidades muito grandes.
- Ausência completa de infecções virais ocultas (latentes) no próprio embrião, o que torna o meio «limpo».
- Alta acessibilidade econômica e simplicidade de execução para qualquer laboratório.
A principal desvantagem do método é que muitos vírus são fisicamente incapazes de se multiplicar nos tecidos de embriões de aves.
Como saber se o vírus se multiplicou (Indicação)? O fato da reprodução viral no embrião é julgado pela morte do embrião, pelo surgimento de lesões específicas em seu corpo ou membranas (pústulas, hemorragias locais), bem como pela reação de hemoaglutinação positiva (RHA), realizada com o líquido extraído das cavidades do embrião infectado.
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Quais tipos de culturas celulares são utilizados para o cultivo de vírus in vitro?
Para cultivar vírus in vitro, utilizam-se vários tipos de culturas celulares.
- Culturas primárias — culturas de células de tecidos humanos.
- Culturas contínuas (linhagens celulares) — culturas de células de tecidos humanos.
- Fibroblastos diploides — fibroblastos humanos que exigem incubação prolongada.
- Culturas de células de embrião suíno — utilizadas para o isolamento de determinados vírus (por exemplo, flavivírus).
- Culturas de células de crescimento rápido — utilizadas no método virológico para o isolamento de vírus DNA.
Quais reações imunológicas específicas são utilizadas para a identificação de vírus?
Para a identificação de vírus, utilizam-se reações imunológicas baseadas na interação entre os antígenos virais e anticorpos conhecidos.
- RN — reação de neutralização (em cultura de células ou em camundongos, utilizando soros tipificados).
- RIF — reação de imunofluorescência.
- ELISA — ensaio imunoenzimático.
- RFC — reação de fixação do complemento.
- RTHA — reação de inibição da hemoaglutinação (por exemplo, com eritrócitos de ganso).
- RPHA — reação de hemoaglutinação passiva.
Quais métodos de indicação viral são aplicados em culturas celulares, além da avaliação do efeito citopático?
Além da avaliação do efeito citopático, os seguintes métodos são aplicados para a indicação de vírus em culturas celulares:
- Formação de inclusões intracelulares — detecção de aglomerados de partículas virais ou de seus componentes; as inclusões podem ser intranucleares ou citoplasmáticas perinucleares.
- Fenômeno de formação de placas — detecção de colônias virais negativas (manchas «estéreis» na monocamada celular sob cobertura de ágar).
- Reações de hemadsorção e hemoaglutinação — detecção da interação do vírus com eritrócitos; na hemadsorção, os eritrócitos aderem às células infectadas.
- Reação «colorida» (teste de cor) — registro da alteração do pH do meio.
Para memorizar as etapas de trabalho com o vírus, utilize a associação: «Primeiro o indicador acende (Indicação — há vírus de fato?), e depois olhamos para o documento de identidade (Identificação — quem exatamente é este vírus?)».
O que mais estudar sobre o tema
- Efeito citopático (ECP) dos vírus nas células
- Mecanismo da reação de hemoaglutinação (RHA)
- Reações imunológicas para identificação de vírus
- Tropismo viral: mecanismos de afinidade tecidual
- Culturas celulares (in vitro) como o terceiro modelo de cultivo
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