Princípios básicos e condições de cultivo
Para o cultivo, escolhem-se com mais frequência tecidos embrionários ou tumorais (malignamente transformados). Sua principal vantagem sobre as células normais de um organismo adulto é a alta capacidade de crescimento ativo e divisão.
Para que a cultura cresça com sucesso fora do organismo, é necessária a estrita observância de cinco parâmetros-chave:
- Assepsia. Observância absoluta da esterilidade em todas as etapas do trabalho.
- Vidraria de laboratório. Utiliza-se exclusivamente vidro quimicamente neutro (frascos de Roux, tubos de ensaio, frascos) ou biorreatores industriais especializados.
- Meios de cultura. As células necessitam de misturas complexas de vários componentes. Geralmente, utilizam-se o meio 199 ou o meio de Eagle. Sua composição inclui aminoácidos, vitaminas, sais minerais, glicose e soro sanguíneo. Soluções tampão são obrigatoriamente adicionadas para estabilizar o pH.
- Proteção antibacteriana. Adicionam-se antibióticos ao meio de cultura. Isso é necessário para suprimir o crescimento de microflora adventícia acidental que possa destruir a cultura.
- Regime de temperatura. A incubação em estufa é realizada estritamente na faixa de 36–38,5 °C.
Tipos de culturas celulares por modo de crescimento
Dependendo da organização do tecido e da natureza da interação celular com o meio, distinguem-se três formas principais:
- Culturas em monocamada. As células fixam-se firmemente à superfície de vidro quimicamente neutro e multiplicam-se, formando uma camada contínua com exatamente uma célula de espessura. Este é o método mais requisitado e frequentemente utilizado na virologia prática.
- Culturas em suspensão. As células não se fixam às paredes, mas flutuam livremente e multiplicam-se em todo o volume do meio de cultura líquido. Para garantir o acesso aos nutrientes e a aeração adequada, é necessária a agitação constante do líquido (por meio de agitadores magnéticos ou em tambores rotativos). Este tipo é ideal para a obtenção industrial de biomassa, por exemplo, na produção de vacinas virais.
- Culturas de órgãos. Neste caso, não são utilizadas células isoladas, mas fragmentos inteiros de tecidos e órgãos. A principal característica do método é a preservação da arquitetura tecidual original. No entanto, devido à complexidade de manter a viabilidade, a aplicação deste tipo é extremamente limitada.
Classificação de culturas por número de gerações (passagens)
A viabilidade das células no laboratório é avaliada pelo número de subcultivos possíveis que elas conseguem suportar.
1. Culturas primárias (primariamente tripsinizadas) São obtidas a partir de tecidos tumorais, normais ou embrionários. Para isso, o material de partida é tratado com enzimas proteolíticas (frequentemente tripsina). A enzima destrói as ligações intercelulares e permite obter uma suspensão de células totalmente isoladas. O principal ponto negativo dessas culturas é a viabilidade extremamente limitada: elas suportam apenas de 5 a 10 passagens (gerações).
2. Culturas contínuas (estabelecidas) Derivam de tecidos com potencial de crescimento extremamente alto — embrionários ou tumorais. São capazes de viver no laboratório por tempo indefinido (dezenas de anos) e suportar inúmeros subcultivos.
- Vantagens: economicidade, baixa exigência de trabalho, alta taxa de multiplicação, capacidade de armazenamento prolongado por congelamento e padronização de processos (utilizam-se linhagens internacionais padronizadas em todo o mundo).
- Desvantagens: as células possuem caráter maligno e acumulam mutações somáticas durante passagens múltiplas. Devido ao seu evidente potencial oncogênico, seu uso é estritamente proibido para a produção de vacinas.
3. Culturas semiculturas (diploides) Ocupam uma posição intermediária. Mais frequentemente, são obtidas de tecidos embrionários humanos. Possuem maior viabilidade do que as primárias (suportam 40–50 passagens), mas não são imortais. Sua principal característica genética é a preservação do conjunto diploide de cromossomos, típico de células somáticas normais, e a ausência de transformação maligna. Devido à sua segurança, são amplamente utilizadas tanto para diagnóstico quanto para produção de vacinas.
Importância do método para a virologia
A introdução das culturas celulares tornou-se uma etapa verdadeiramente revolucionária no desenvolvimento da ciência:
- Identificação. O método permitiu aos cientistas isolar e descrever um enorme número de vírus até então desconhecidos pela ciência.
- Especificidade. Os pesquisadores obtiveram a capacidade de selecionar com precisão as linhagens celulares mais sensíveis para o cultivo de espécies virais específicas.
- Profundidade das pesquisas. Tornou-se possível o estudo detalhado dos processos de interação entre o vírus e a célula viva em um nível molecular refinado.
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Quais linhas celulares contínuas específicas (cepas) são mais frequentemente utilizadas na prática virológica?
As fontes mencionam as seguintes linhagens celulares contínuas específicas utilizadas no cultivo de vírus:
- HeLa — linhagem contínua indicada para o cultivo de paramixovírus.
- Vero — linhagem contínua indicada para o cultivo de paramixovírus.
- BHK-21 — linhagem contínua indicada para o cultivo de togavírus.
- BHK-21 — cultura de células de rim de hamster, na qual o ECP dos flavivírus se manifesta claramente.
- SPEV — cultura de células de rim suíno, na qual o ECP dos flavivírus se manifesta claramente.
Por meio de quais métodos (fenômenos) realiza-se a indicação da replicação viral em cultura celular?
A indicação da replicação viral em cultura celular é realizada por meio dos seguintes fenômenos específicos:
- Efeito citopatogênico — identificação de alterações morfológicas ou destruição de células infectadas.
- Formação de inclusões intracelulares — detecção de aglomerados de partículas virais ou componentes no citoplasma e no núcleo.
- Formação de "placas" — identificação de colônias virais negativas (manchas "estéreis") na camada celular.
- Hemadsorção — adesão de eritrócitos às membranas de células infectadas.
- Hemaglutinação — interação de vírus liberados das células com eritrócitos no líquido de cultura.
- Reação "colorida" — alteração na cor do indicador do meio de cultura devido ao deslocamento do pH.
Quais são os principais tipos de efeito citopatogênico (ECP) dos vírus na monocamada celular?
As fontes não fornecem uma classificação completa dos tipos de ECP viral na monocamada celular. As seguintes manifestações de ECP e sinais associados de reprodução viral em cultura celular foram descritos:
- Alterações morfológicas celulares — efeito citopatogênico (ECP).
- Destruição celular — o ECP pode se manifestar pela destruição das células.
- Formação de sincícios — células gigantes multinucleadas; característica de paramixovírus devido à atividade da proteína F.
- Formação de inclusões intracelulares — inclusões específicas visíveis à microscopia; podem ser citoplasmáticas ou intranucleares.
O grau de expressão do ECP pode variar: nos togavírus é acentuado, nos flavivírus é pouco expressivo.
Para memorizar a classificação por passagens (número de subcultivos): Primárias (apenas começaram, 5–10 passagens, necessitam de tripsina), Semiculturas (metade do caminho, 40–50 passagens, seguras para vacinas), Contínuas (sobrevivem a todos, passagens infinitas, mas tumorais e mutadas).
Questões de aulas e exames
Por que é proibido o uso de linhagens celulares contínuas para a produção de vacinas?
As linhagens contínuas originam-se de tecidos malignos e acumulam mutações somáticas durante passagens infinitas. Por causa disso, possuem potencial oncogênico e não podem ser consideradas seguras para humanos.
Para que se utiliza a enzima tripsina na obtenção de culturas primárias?
A tripsina é uma enzima proteolítica que degrada proteínas. Ela é necessária para destruir as fortes ligações intercelulares no fragmento de tecido original, a fim de obter uma suspensão de células individuais e isoladas umas das outras.
Qual é a diferença entre culturas em suspensão e culturas em monocamada?
Nas culturas em monocamada, as células multiplicam-se apenas quando fixadas à superfície do vidro em uma única camada. Nas culturas em suspensão, as células encontram-se em estado de suspensão em todo o volume do meio líquido, o que exige agitação constante para garantir o fornecimento de oxigênio e nutrientes.
O que mais estudar sobre o tema
- Composição detalhada e finalidade dos componentes do meio 199 e do meio de Eagle
- Mecanismos moleculares da interação do vírus com a célula suscetível
- Tecnologias de produção industrial de vacinas virais em biorreatores
- Criopreservação: regras para o armazenamento de longo prazo de linhagens contínuas em estado congelado
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