Gel-filtration : séparation selon la masse moléculaire
Cette méthode repose sur l'effet de tamis moléculaire. Le principe consiste à filtrer les molécules protéiques à travers un support spécialisé : les billes gonflées de séphadex.
Le séphadex en soi représente une structure spatiale complexe. Ce sont des chaînes polysaccharidiques tridimensionnelles de dextrane, à l'intérieur desquelles sont formés des pores d'un diamètre déterminé. Lors du passage du mélange à travers la colonne, la vitesse de progression des différentes protéines dépend directement de leur masse moléculaire.
La séparation s'effectue selon le principe suivant :
- Les molécules de plus faible masse pénètrent librement dans l'espace interne des pores des billes de séphadex. De ce fait, leur trajet s'allonge, elles sont retardées dans la colonne et en sortent nettement plus tard.
- Les molécules de grande masse, en revanche, sont physiquement incapables de pénétrer à l'intérieur des pores du dextrane. Elles contournent les billes par l'extérieur et sont par conséquent éluées (lavées) plus rapidement de la colonne chromatographique.
Chromatographie échangeuse d'ions : rôle de la charge électrique
Ce type de fractionnement est fondé sur l'interaction électrostatique. Le processus se déroule grâce à la liaison des groupes ionisés des protéines elles-mêmes avec les groupes fonctionnels de charge opposée du support. Ces supports sont des résines échangeuses d'ions, des matériaux polymères insolubles particuliers.
Règle clé de la méthode : la force d'adsorption (liaison de la protéine à la résine) est strictement proportionnelle à la valeur de la charge électrique de la molécule protéique. Plus la protéine est chargée, plus elle est fixée solidement sur le polymère.
Pour décrocher la protéine isolée de la colonne, on applique la procédure d'élution (de lavage). Les protéines adsorbées sont éluées à l'aide de solutions de chlorure de sodium (NaCl). La concentration en sel est alors progressivement augmentée. La règle d'élution est la suivante : plus la charge est faible pour une protéine donnée, plus la concentration de NaCl nécessaire pour rompre sa liaison avec les groupes ionogènes de la résine et l'éluer dans le tube sera faible.
Chromatographie d'affinité : spécificité absolue
Parmi toutes les approches examinées, la chromatographie d'affinité se distingue comme la méthode la plus spécifique pour isoler des protéines individuelles. Elle permet de « capturer » de manière ciblée la macromolécule recherchée au sein de mélanges très complexes.
Le mécanisme de cette méthode comprend plusieurs étapes successives :
- Préparation du support : un ligand — une molécule avec laquelle la protéine cible interagit dans des conditions physiologiques — est solidement fixé à un polymère chimiquement inerte par liaison covalente.
- Passage du mélange : la solution de protéines est déposée sur la colonne. À cet instant se produit une liaison complémentaire stricte de la protéine recherchée avec le ligand immobilisé.
- Résultat final : seule la protéine spécifique de ce ligand particulier est adsorbée sur la colonne polymère. Toutes les autres protéines (indésirables) passent librement sans s'attarder.
Pour mémoriser le principe de la gel-filtration, imaginez un labyrinthe (les pores du séphadex) : les « petites » souris (protéines de plus faible masse) se faufilent dans chaque terrier et s'attardent, tandis que les « grands » éléphants (protéines de grande masse) ne peuvent passer les portes et courent tout droit vers la sortie par le couloir principal.
Questions des cours et des examens
Avec quoi élue-t-on les protéines en chromatographie échangeuse d'ions ?
Les protéines adsorbées sur les résines échangeuses d'ions sont lavées avec des solutions de NaCl. On utilise pour cela une méthode par gradient — la concentration en sel est augmentée progressivement en fonction de la charge de la protéine.
Quelle méthode de chromatographie est considérée comme la plus spécifique ?
La chromatographie d'affinité est la méthode la plus spécifique, car elle repose sur la liaison complémentaire d'une protéine individuelle avec son ligand spécifique, fixé par covalence au polymère.
À étudier également sur le sujet
- Structure tridimensionnelle et propriétés des chaînes polysaccharidiques de dextrane.
- Nature chimique des résines échangeuses d'ions insolubles.
- Mécanismes de fixation covalente du ligand sur un polymère inerte.
- Nature de la liaison complémentaire entre la protéine et le ligand.
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