Dosage radio-immunologique (RIA)
La méthode radio-immunologique repose sur une réaction hautement sensible de liaison entre un antigène et un anticorps. Le rôle de marqueur indicateur y est joué par des radionucléides — le plus souvent des isotopes de l'iode, du carbone ou du tritium.
Techniquement, le processus de recherche se résout à la séparation du complexe immun radioactif formé et à la mesure ultérieure du niveau de rayonnement bêta ou gamma à l'aide d'un compteur spécial. L'intensité du rayonnement radioactif enregistré est en corrélation mathématique directe avec le nombre de molécules liées.
Il existe deux variantes principales de mise en œuvre de la réaction :
- RIA en phase solide. L'un des composants réagissants (antigène ou anticorps) est préalablement adsorbé sur un support solide, par exemple dans les puits d'une plaque en polystyrène.
- RIA compétitif. Utilisé pour un comptage quantitatif précis. L'antigène recherché de l'échantillon du patient et l'antigène marqué standard ajouté entrent en compétition pour un pool limité d'anticorps.
La méthode possède une sensibilité colossale, détectant des concentrations mineures de substances, mais présente un certain danger écologique en raison de la nécessité de manipuler des sources de rayonnement. Elle est utilisée en laboratoire pour déterminer les taux d'hormones, d'enzymes, de médicaments, d'immunoglobulines et d'antigènes microbiens.
Immunoblocage (Western blot)
L'immunoblocage, également connu sous le nom de Western Blot, est une approche diagnostique complexe qui combine les capacités de l'électrophorèse, du transfert de fractions et de l'immuno-enzymologie (ou du dosage radio-immunologique). C'est un outil indispensable pour le diagnostic de confirmation, dont un exemple classique est la vérification de l'infection par le VIH.
L'examen se déroule en trois étapes successives :
- Électrophorèse. Les antigènes de l'agent pathogène sont séparés dans un gel de polyacrylamide sous l'effet d'un courant électrique. Les fractions se répartissent strictement en fonction de leur masse moléculaire et de leur charge.
- Blotting (transfert). Les antigènes séparés sont répliqués du gel vers une membrane de nitrocellulose. La disposition topographique exacte des bandes invisibles (blots) est ainsi préservée.
- Révélation. À l'étape diagnostique, on utilise des strips (bandes) commerciaux prêts à l'emploi portant les blots appliqués. Le sérum du patient à analyser y est déposé. Si des anticorps spécifiques sont présents dans le sang, ils se lient aux antigènes. Après lavage des éléments non liés, on ajoute des anticorps secondaires anti-espèces (dirigés contre les immunoglobulines humaines) portant un marqueur enzymatique. L'apport d'un chromogène provoque un changement de couleur du substrat, et des bandes nettes sont visualisées sur la membrane.
Microscopie électronique immunologique
Cette méthode associe habilement le pouvoir de résolution de la microscopie électronique à la spécificité des réactions sérologiques. Le principal objectif de la méthode est l'étude visuelle détaillée des micro-organismes, principalement les virus.
Lors du traitement de particules virales par un sérum immunitaire spécifique, il se produit la formation de grands agrégats immuns. Les anticorps entourent densément les virions, créant autour d'eux une « couronne » protéique caractéristique. Cette couche assure un contraste optique et électronique marqué, grâce auquel les particules virales et leurs amas deviennent clairement visibles.
Pour renforcer encore la visibilité, on utilise un marquage par des marqueurs électron-denses. En particulier, les anticorps sont conjugués à la ferritine, une protéine spéciale contenant du fer qui retient excellemment le faisceau d'électrons et aide à localiser les antigènes recherchés.
Cytométrie en flux
La cytométrie en flux est une méthode instrumentale d'analyse des populations cellulaires, de différenciation des cellules sanguines et de leur identification par les antigènes CD de surface.
Avant le début de l'analyse, la suspension cellulaire est colorée de manière spécifique par des anticorps monoclonaux préalablement marqués par des fluorochromes. Le cytomètre lui-même met en œuvre le principe de focalisation hydrodynamique : les cellules s'alignent dans un capillaire en une seule file et traversent la zone d'irradiation laser strictement une par une.
Le laser remplit deux tâches clés :
- Évaluation de la morphologie. Le détecteur de diffusion de la lumière à l'avant enregistre la taille et la granularité interne de la cellule en transit.
- Évaluation des marqueurs. Le laser excite l'émission des marqueurs fluorochromes fixés. L'intensité de la fluorescence reflète la densité des antigènes CD sur la membrane.
Le système optique complexe de l'appareil utilise des miroirs dichroïques pour séparer la lumière émise par longueurs d'onde (par exemple, le spectre vert de 530–550 nm et le rouge de 560–580 nm). Le signal dirigé vers les photomultiplicateurs est converti en un histogramme graphique.
| Direction diagnostique | Ce qui est évalué précisément par la méthode |
|---|---|
| Profil cellulaire | Teneur quantitative des populations lymphocytaires |
| Activité fonctionnelle | Phagocytose et activité des cellules NK (natural killers) |
| Statut cytokinique | Niveau de production de diverses cytokines |
| Viabilité | Caractéristiques de la mort cellulaire (apoptose, pyroptose) |
En bref : réponses aux questions sur le sujet
Quels types de rayonnements sont enregistrés par le compteur lors de la séparation du complexe immun radioactif en RIA ?
Lors de la séparation du complexe immun radioactif en dosage radio-immunologique, le compteur enregistre un rayonnement $\beta$ ou $\gamma$. Pour marquer les antigènes ou les anticorps dans cette méthode, on utilise des radionucléides tels que les isotopes $^{125}\text{I}$, $^{14}\text{C}$ et $^3\text{H}$. L'intensité du rayonnement enregistré est directement proportionnelle au nombre de molécules liées. La méthode se distingue par une sensibilité extrêmement élevée et permet de détecter des concentrations mineures de substances (hormones, enzymes, antigènes microbiens), mais présente un danger écologique en raison de la nécessité de travailler avec des radiations.
Quels miroirs dichroïques exacts sont utilisés pour séparer la lumière émise par longueurs d'onde en cytométrie en flux ?
En cytométrie en flux, on utilise des séparateurs de faisceau (miroirs dichroïques) qui séparent la lumière émise selon sa longueur d'onde. Les sources ne précisent pas de marques ou de types de miroirs spécifiques, mais indiquent qu'ils dirigent la lumière vers les cellules photoélectriques correspondantes en isolant des spectres déterminés :
- Spectre vert — longueur d'onde de 530–550 nm.
- Spectre rouge — longueur d'onde de 560–580 nm.
La séparation se produit après que le faisceau laser a excité l'émission des fluorochromes à la surface des cellules traversant le capillaire fin.
Quelles enzymes spécifiques sont utilisées pour obtenir le marqueur enzymatique dans les anticorps secondaires anti-espèces lors du blotting ?
Les sources ne précisent pas les enzymes exactes utilisées dans la composition des anticorps secondaires anti-espèces lors de l'immunoblocage. Il est seulement indiqué que ces anticorps sont marqués par une enzyme, et qu'après leur application, on ajoute un substrat ou un chromogène provoquant la coloration des bandes.
À étudier également sur le sujet
- Mécanismes de l'apoptose et de la pyroptose, évalués en cytométrie en flux
- Spectre des antigènes CD et leur rôle dans l'identification des lymphocytes
- Bandes protéiques spécifiques (blots) ayant une importance dans le diagnostic de l'infection par le VIH
- Principes physiques du fonctionnement des photomultiplicateurs en cytofluorométrie laser
- Isotopes utilisés en dosage radio-immunologique et leur innocuité physiologique
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