Principe général et mécanisme de la réaction
Dans le test immuno-enzymatique (ELISA), le conjugué joue un rôle clé : il s'agit d'anticorps auxquels une enzyme est chimiquement liée. Le plus souvent, la peroxydase de raifort, la $\beta$-galactosidase ou la phosphatase alcaline sont utilisées comme marqueurs.
La réaction se déroule en plusieurs étapes :
- Formation du complexe immunitaire antigène-anticorps.
- Ajout d'un substrat spécifique ou d'un chromogène.
- L'enzyme présente dans le conjugué clive le substrat.
- Le clivage entraîne un changement de couleur de la solution.
L'intensité de la coloration obtenue dépend directement du nombre de molécules liées. Cela permet d'effectuer une quantification de la substance analysée. Pour arrêter la réaction au moment souhaité, on ajoute de l'acide au mélange, ce qui dénature l'enzyme.
ELISA en phase solide
L'ELISA en phase solide (ELISA) est la méthode la plus répandue. Sa principale caractéristique est qu'un des composants (antigène ou anticorps) est préalablement fixé (sorbé) sur un support solide. Les puits de plaques en polystyrène jouent généralement le rôle de support.
Une condition essentielle à la réussite de l'ELISA en phase solide est le lavage minutieux des puits de la plaque après chaque ajout d'un nouveau réactif. Cela est nécessaire pour éliminer complètement toutes les molécules non liées afin d'éviter l'apparition de faux positifs.
Principales variantes de l'ELISA
Selon les objectifs diagnostiques, différentes méthodes d'analyse sont utilisées :
- Détection des anticorps (sérologie) : L'objectif est de trouver des immunoglobulines spécifiques contre l'agent pathogène dans le sérum du patient. Un antigène connu est fixé au fond du puits. Lors de l'ajout du sérum du patient, ses anticorps (s'ils sont présents) se lient à l'antigène. Ensuite, on ajoute le conjugué (sérum antiglobulinique avec une enzyme), qui se fixe aux fragments Fc des anticorps du patient. L'ajout du substrat provoque une coloration.
- Détection des antigènes (méthode en « sandwich ») : Utilisée pour rechercher l'agent pathogène lui-même ou ses fragments. Des anticorps diagnostiques sont fixés dans le puits. Ils « capturent » l'antigène recherché présent dans le sérum du patient. Ensuite, des anticorps marqués dirigés contre le même antigène sont introduits, fermant ainsi le complexe (« sandwich »). La présence de l'enzyme est confirmée par une réaction colorée.
- ELISA compétitif : Cette méthode repose sur la compétition entre des molécules pour un nombre limité de sites de liaison. Par exemple, lors de la recherche d'un antigène, l'antigène recherché du patient et un antigène standard marqué ajouté entrent en compétition pour se lier aux anticorps.
Application en pratique clinique
Grâce à sa sensibilité extrêmement élevée (détection de concentrations allant jusqu'à $10^{-10}$ — $10^{-12}$ g/L), l'ELISA est largement utilisé en médecine moderne.
Principaux domaines d'application :
- Diagnostic des maladies infectieuses : virales (notamment l'hépatite B et le VIH), bactériennes, parasitaires.
- Dosage quantitatif de molécules biologiquement actives, telles que les hormones et les enzymes.
- Suivi de la concentration des médicaments dans l'organisme.
En bref : réponses aux questions sur le sujet
Quelles classes d'anticorps (immunoglobulines) sont déterminées de manière différentielle par ELISA pour évaluer le stade du processus infectieux ?
L'ELISA permet de déterminer de manière différentielle les immunoglobulines des classes M et G.
- Les immunoglobulines de classe M (IgM) sont un marqueur d'infection récente ; dans le cas d'une infection à herpèsvirus, une augmentation du titre d'IgM par un facteur de 4 ou plus indique une infection primaire.
- Les immunoglobulines de classe G (IgG) — dans le cas d'une infection à herpèsvirus, une élévation du titre indique une forme récurrente de la maladie ; en cas d'infection à rotavirus, l'immunité post-infectieuse est due aux anticorps de classe IgG.
Pour mémoriser le principe de la méthode en sandwich, imaginez un sandwich : la tranche de pain du bas représente les anticorps fixés au fond du puits, la garniture (la viande) est l'antigène recherché provenant du sang du patient, et la tranche de pain du haut correspond aux anticorps marqués ajoutés qui complètent l'ensemble.
Questions des cours et des examens
Qu'est-ce qu'un conjugué en ELISA ?
Un conjugué est un anticorps solidement lié (conjugué) à une molécule d'enzyme qui sert de marqueur pour la visualisation ultérieure de la réaction.
Quelle est la différence entre la méthode de détection directe et indirecte ?
Le schéma de recherche d'anticorps dans le sérum (sérologie) est une méthode indirecte, car le marqueur enzymatique se trouve sur les anticorps secondaires (antiglobuliniques), tandis que la méthode en sandwich vise à rechercher des antigènes.
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