Coloration de Gram : méthode, étapes, bactéries Gram+ et Gram−

1. Histoire et auteur

• Développée en 1884 par le microbiologiste danois Hans Christian Gram.
• À l'origine, pour différencier le pneumocoque de la klebsiellle dans des prélèvements pulmonaires.
• Depuis les années 1920, standard en microbiologie médicale.
• Fondée sur les différences de structure de la paroi cellulaire.

2. Méthode (4 étapes)

• Entre les étapes — rincer à l'eau distillée.
• Critique : ne pas prolonger l'étape de décoloration → faux négatifs (les Gram+ deviennent roses).
• Prélèvement — natif (suraches, urine, LCR, liquide de plaie) ou issu de colonies sur milieu gélosé.

3. Structure de la paroi cellulaire

Bactéries Gram+

• Couche épaisse de peptidoglycane (20–80 nm).
• Acides téichoïques et lipotéichoïques.
• Absence de membrane externe.
• Le complexe peptidoglycane-iode-violet de gentiane est volumineux, non éliminé par l'alcool.
• Sensibles aux pénicillines, à la vancomycine, au lysozyme.

Bactéries Gram−

• Couche fine de peptidoglycane (2–7 nm).
• Membrane externe avec lipopolysaccharide (LPS, endotoxine) et porines.
• Espace périplasmique entre les deux membranes.
• Lors du traitement par l'alcool, la couche lipidique est dissoute → le complexe est éliminé.
• Résistantes à la vancomycine (ne pénètre pas à travers la membrane externe).

4. Bactéries Gram+ — principales

5. Bactéries Gram− — principales

6. « Ne se colorent pas au Gram »

• Mycobactéries (M. tuberculosis, M. leprae) — paroi cireuse ; coloration de Ziehl-Neelsen (BAAR).
• Mycoplasmes (M. pneumoniae) — pas de paroi cellulaire ; invisibles à la coloration de Gram.
• Spirochètes (T. pallidum, Borrelia) — fins, se colorent mal ; microscopie sur fond noir, imprégnation argentique.
• Chlamydias, rickettsies — parasites intracellulaires.
• Legionella — nécessite une imprégnation argentique ou des milieux spécifiques (BCYE).

7. Application clinique

• Crachats — orientation rapide en cas de pneumonie communautaire et nosocomiale.
• LCR — en urgence pour la méningite : coques Gram+ en diplocoques = pneumocoque ; coques Gram− en diplocoques = méningocoque ; bacilles Gram− = H. influenzae.
• Urine — en cas d'urosepsis ; bacilles Gram− = le plus souvent groupe entérique.
• Sang (à partir des flacons d'hémoculture) — en cas de sepsis.
• Liquide de plaie, pus.
• Frottis urétral/cervical — gonorrhée (diplocoques Gram− intranétrophiliques).

8. Antibiothérapie empirique

• Coques Gram+ dans les crachats en cas de pneumonie communautaire — ceftriaxone ± macrolide ; pneumocoque probable.
• Bacilles Gram− dans les urines — ceftriaxone, fluoroquinolones.
• Diplocoques Gram+ dans le LCR — ceftriaxone + vancomycine (pneumocoque, résistance possible).
• Diplocoques Gram− dans le LCR — ceftriaxone (méningocoque) ; prophylaxie des contacts.
• Flore mixte dans le liquide péritonéal — β-lactamine + anti-anaérobie (métronidazole) ou carbapénème.
• Bacilles Gram+ anaérobies sporulés — suspecter une infection à clostridies.

9. Limites de la méthode

• Sensibilité ~60–80 % (nécessite ≥ 10⁵ cellules par champ pour une évaluation fiable).
• Qualité de l'échantillon : crachats — contrôle selon les critères (< 10 cellules épithéliales et > 25 neutrophiles par champ à ×100).
• Ne distingue pas les cellules viables des cellules mortes.
• Ne donne pas de diagnostic d'espèce (nécessite culture + biochimie + spectrométrie de masse MALDI-TOF).
• Ne remplace pas l'antibiogramme — celui-ci est déterminé uniquement après la mise en culture.

10. Erreurs d'examen

• Surcoloration à l'alcool — faux négatifs (les Gram+ apparaissent comme des Gram−).
• Sous-coloration — faux positifs.
• Cultures vieillissantes — les Gram+ peuvent présenter un aspect gram-variable (lié à l'amincissement de la paroi).
• Frottis excessivement épais — mauvaise décoloration.
• Contamination — nombreux morphotypes.

11. Alternatives modernes et compléments

• Culture avec identification par MALDI-TOF (spectrométrie de masse) — diagnostic d'espèce en 15 min.
• Panneaux PCR (Septi-Fast, FilmArray BCID/GI/RP) — détection rapide des agents pathogènes dans le sang, le LCR, les prélèvements respiratoires.
• Séquoïage de l'ARNr 16S — identification en cas de culture négative.
• Tests antigéniques (pneumococcique, légionellose urinaire).
• La coloration de Gram reste le premier examen de dépistage en raison de sa rapidité et de son faible coût.

12. FAQ

Pourquoi les mycobactéries ne se colorent-elles pas au Gram ?
Leur paroi cellulaire contient des acides mycoliques de haut poids moléculaire et de la cire → la surface hydrophobe ne laisse pas passer les colorants hydrosolubles. On utilise une coloration acido-alcoolo-résistante (Ziehl-Neelsen, auramine fluorochrome).

Qu'appelle-t-on bactéries gram-variables ?
Des bactéries qui donnent des résultats variables selon les conditions : vieilles bactéries Gram+ (amincissement de la paroi), certaines clostridies, listérias. Correspondent généralement à de vrais Gram+.

Pourquoi les bacilles Gram− dans les urines sont-ils le plus souvent E. coli ?
Escherichia coli est un commensal normal du tube digestif et la principale cause d'infections urinaires communautaires (70–80 %). C'est la première hypothèse en présence de bacilles Gram− dans les urines.

Peut-on différencier S. aureus de S. epidermidis par la coloration de Gram ?
Non. Ce sont tous deux des coques Gram+ en grappes. On les différencie par la coagulase (S. aureus +), la catalase (les deux +) et la biochimie.

Pourquoi la vancomycine est-elle inefficace contre les bactéries Gram− ?
La vancomycine est une grosse molécule qui se lie au D-Ala-D-Ala dans le peptidoglycane. Les bactéries Gram− possèdent une membrane externe dotée de petites porines à travers lesquelles la vancomycine ne peut pas pénétrer.

Voir aussi : Antibiotiques · Sepsis · Méningite · Tuberculose · Catalogue de microbiologie