Métodos microscópicos
Para estudiar la estructura de los objetos biológicos se utilizan instrumentos especiales: micrótomos (para preparar cortes ultrafinos), lupas manuales o de soporte, así como microscopios ópticos y electrónicos.
La microscopía óptica utiliza luz visible o radiación ultravioleta. Dependiendo del tipo de objeto y de las tareas, se aplican diferentes modificaciones del método:
- Microscopía de contraste de fases. Aumenta significativamente el contraste de la imagen, lo cual es especialmente importante para estudiar estructuras transparentes y no teñidas.
- Microscopía de polarización. Se basa en el fenómeno de la birrefringencia (anisotropía). En este microscopio, las estructuras anisótropas aparecen como elementos muy brillantes sobre un fondo completamente oscuro.
- Microscopía de interferencia. El haz de luz se divide: una parte atraviesa la célula y la otra pasa junto a ella. El haz transmitido experimenta un cambio de fase, y la imagen resultante se construye según la diferencia de densidad de las zonas celulares (a mayor densidad, mayor contraste).
- Microscopía de campo oscuro. La imagen se crea mediante la reflexión de la luz en el objeto de estudio. Las partículas más pequeñas se ven como puntos brillantes sobre un fondo oscuro, ya que la luz directa no penetra en el objetivo.
- Microscopía ultravioleta. Se basa en la capacidad de los componentes celulares para absorber específicamente rayos de una longitud de onda determinada. Permite identificar estructuras sin tinción previa.
- Microscopía de fluorescencia. Se aplica a células vivas bajo luz ultravioleta. Se evalúa la autofluorescencia de las sustancias o la fluorescencia tras añadir colorantes (fluorocromos). Ayuda a visualizar lípidos, vitaminas y ácidos nucleicos.
La microscopía electrónica alcanza la máxima resolución posible mediante el uso de un haz de electrones en lugar de luz convencional.
- De transmisión. La imagen se forma en una pantalla fluorescente al dispersarse el haz de electrones. Cuanto mayor sea la capacidad de dispersión de una zona concreta (retiene más electrones), más oscura se verá.
- De barrido (escaneo). Un haz de electrones recorre la superficie, lo que permite obtener una imagen tridimensional de la superficie celular.
Estudio de la composición química
Además de la estructura, a los investigadores les interesa comprender la composición química y la distribución de las sustancias dentro de la célula. Para ello se emplea un grupo específico de métodos:
- Métodos citoquímicos. Se basan en la unión específica de ciertos colorantes con componentes químicos concretos de la célula.
- Autorradiografía. Se introducen en la célula sustancias marcadas con radionúclidos (isótopos radiactivos), tras lo cual los aparatos registran su desplazamiento y acumulación.
- Métodos inmunohistoquímicos. Utilizan la reacción antígeno-anticuerpo para determinar con precisión antígenos en las células y detectar anticuerpos tisulares.
- Citoespectrofotometría. Permite evaluar cuantitativamente el contenido de sustancias. El método se basa en medir la absorción de rayos luminosos de una longitud de onda determinada.
- Difracción de rayos X. Un método altamente especializado que se utiliza para descifrar la configuración espacial de moléculas complejas, principalmente proteínas y ácidos nucleicos.
Estudios fisiológicos y vitales
Para comprender cómo funciona la célula en tiempo real, se aplican métodos vitales (in vivo):
- Coloración vital. Las células vivas se tratan con colorantes en concentraciones muy bajas. Esto evita el efecto tóxico y la muerte del objeto.
- Método de cultivo de tejidos. Las células vivas (por ejemplo, de un cultivo tisular) se colocan en un medio nutritivo artificial donde pueden crecer y multiplicarse de forma autónoma fuera del organismo.
- Método citofisiológico. Implica el estudio de los procesos fisiológicos en células aisladas, como en células musculares, troncos nerviosos o ganglios.
- Estudio vital de las células. Observación de protozoos de vida libre o células sanguíneas vivas.
- Microcirugía. Realización de microintervenciones en la propia célula y sus organelas mediante micromanipuladores especiales.
Método de fraccionamiento
Para el estudio detallado de la composición de los componentes celulares individuales se utiliza la ultracentrifugación diferencial. Este método se basa en la separación de organelas e inclusiones intracelulares según su densidad. El tejido se coloca en un aparato especial: la ultracentrífuga. Debido a la rotación de gran velocidad, las organelas sedimentan formando capas nítidas de acuerdo con su densidad. Posteriormente, estas capas se separan con cuidado y se estudian por separado.
En resumen: respuestas a preguntas sobre el tema
¿Qué colorantes se utilizan para los métodos de investigación citoquímica?
Para las investigaciones citoquímicas se emplea el ácido peryódico-Schiff (reactivo de Schiff o fucsina ácida decolorada). Este reactivo se usa en la reacción de Feulgen para la detección microscópica específica del ADN en la célula.
Resultados de la aplicación del colorante:
- Cromatina nuclear: adquiere un tono cereza (violeta) debido a la alta concentración de ADN.
- Nucléolos y citoplasma: se tiñen de verde.
En los materiales no se mencionan los nombres de otros colorantes citoquímicos, pero se subraya que el principio del método radica en la unión específica de los colorantes con determinados componentes químicos de la célula.
Para recordar los tipos de microscopía óptica, utiliza la frase: «Faisán Completamente Ignoraba la Oscura Ultra-Fluorescencia» (Fase-contraste, Polarización, Interferencial, Campo oscuro, Ultravioleta, Fluorescencia).
Preguntas de clases y exámenes
¿Cuál es la diferencia entre la microscopía electrónica de transmisión y la de barrido?
La microscopía de transmisión forma la imagen mediante la dispersión de un haz de electrones al atravesar el objeto, mostrando su estructura interna. La de barrido se utiliza para obtener una imagen tridimensional y volumétrica de la superficie celular.
¿En qué se basa el método de centrifugación diferencial?
Se basa en el uso de una ultracentrífuga que gira a gran velocidad. Las organelas se separan y sedimentan en capas, estrictamente de acuerdo con su densidad.
¿Cómo funciona la microscopía de fluorescencia?
El método evalúa la fluorescencia de una célula viva bajo luz ultravioleta. Se estudia ya sea la autofluorescencia de las sustancias o la emisión tras añadir colorantes especiales: los fluorocromos.
Qué más repasar sobre el tema
- Mecanismos de unión específica de los colorantes en citoquímica
- Principio de funcionamiento del micrótomo y etapas de preparación de cortes histológicos
- Características de la reacción antígeno-anticuerpo en el método inmunohistoquímico
- Propiedades de los isótopos radiactivos empleados en autorradiografía
- Selección de medios de cultivo para el método de cultivo de tejidos
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