Fundamentos de la cinética de las reacciones enzimáticas
Cinética de las reacciones enzimáticas: rama de la enzimología que estudia la dependencia de la velocidad del proceso enzimático respecto a la naturaleza química de las sustancias y las condiciones del medio. La velocidad de la reacción no se mide directamente, sino a través del cambio en la concentración del sustrato (su consumo) o mediante la velocidad de acumulación del producto.
La velocidad de una reacción enzimática se ve afectada por:
- la cantidad y la actividad catalítica de la enzima;
- la concentración del sustrato;
- la temperatura del medio;
- el pH del medio;
- la presencia de activadores e inhibidores.
La dependencia de la velocidad inicial de la reacción con respecto a la concentración del sustrato se representa gráficamente como una hipérbola. A bajas concentraciones de sustrato, los centros activos de las enzimas están libres y la velocidad aumenta proporcionalmente a [S]. A medida que los centros activos se saturan con el sustrato, se alcanza una meseta: la velocidad máxima de la reacción (Vmax), en la cual todas las moléculas de la enzima se encuentran formando parte del complejo enzima-sustrato y no logran «cambiar» a tiempo hacia nuevas moléculas de sustrato.
Constante de Michaelis y su significado biológico
Constante de Michaelis (Km): concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción alcanza la mitad de la máxima (½ Vmax). La Km se expresa en unidades de concentración (por ejemplo, mmol/l) y caracteriza la afinidad de la enzima por el sustrato:
- cuanto menor es la Km, mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato; la enzima «reconoce» el sustrato incluso a bajas concentraciones de este;
- cuanto mayor es la Km, menor es la afinidad; se requiere una gran concentración de sustrato para que la enzima actúe de manera activa.
Un ejemplo clásico son las isoenzimas que fosforilan la glucosa hasta glucosa-6-fosfato a expensas del ATP:
- La hexocinasa está presente en la mayoría de los tejidos; su Km es de aprox. 0,1 mmol/l. Esto es considerablemente menor que la concentración fisiológica de glucosa en sangre (3,3–5,5 mmol/l), por lo que la enzima funciona de manera eficiente incluso en presencia de hipoglucemia.
- La glucocinasa se localiza predominantemente en los hepatocitos; su Km es de aprox. 10 mmol/l. Se «activa» únicamente ante concentraciones elevadas de glucosa, por ejemplo, después de la ingesta de alimentos, lo que asegura el depósito de glucosa en el hígado en forma de glucógeno.
Ecuación de Michaelis-Menten
La dependencia de la velocidad inicial de la reacción (V₀) con respecto a la concentración del sustrato se describe mediante la ecuación de Michaelis-Menten:
V₀ = Vmax · [S] / (Km + [S])
La ecuación permite calcular V₀ conociendo Vmax, Km y [S], o bien hallar uno de los parámetros si se conocen los otros dos. Gráficamente, en coordenadas de V₀ frente a [S], genera una hipérbola, lo cual resulta poco práctico para la determinación exacta de Vmax y Km en un experimento, ya que la asíntota hacia Vmax se alcanza solo de forma teórica.
Gráfico de Lineweaver-Burk
Para facilitar el análisis experimental, la ecuación de Michaelis-Menten se transforma en coordenadas dobles recíprocas:
1/V₀ = (Km/Vmax) · (1/[S]) + 1/Vmax
Esta ecuación corresponde a una línea recta: el gráfico de Lineweaver-Burk. En él:
- la intersección de la recta con el eje de ordenadas corresponde a 1/Vmax;
- la intersección con el eje de abscisas corresponde a −1/Km;
- la pendiente de la recta es igual a Km/Vmax.
La forma lineal permite determinar con precisión los parámetros a partir de los puntos experimentales y comparar de forma visual la acción de diferentes tipos de inhibidores.
Inhibición reversible: competitiva y no competitiva
La inhibición es la disminución de la actividad catalítica de la enzima bajo la acción de inhibidores. Se distingue entre inhibición irreversible (con formación de enlaces covalentes estables) y reversible. Entre los inhibidores reversibles se destacan los competitivos y los no competitivos.
Inhibición competitiva
Un inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato que se une al centro activo de la enzima, pero no se convierte en producto. Ejemplos: el malonato como inhibidor de la succinato deshidrogenasa (siendo el sustrato el succinato); la proserina y el edrofonio como inhibidores de la acetilcolinesterasa.
- La Vmax no se modifica; el inhibidor puede ser desplazado mediante un exceso de sustrato;
- La Km aumenta; la afinidad aparente de la enzima por el sustrato disminuye.
En el gráfico de Lineweaver-Burk, las rectas con y sin inhibidor se cruzan en el eje de ordenadas (igual valor de 1/Vmax), pero presentan distinta pendiente y diferente −1/Km.
Inhibición no competitiva
Un inhibidor no competitivo se une a la enzima en un sitio distinto al centro activo (por ejemplo, en un sitio alostérico), alterando la conformación del centro activo. Un aumento en [S] no restablece la actividad de la enzima.
- La Km no se modifica;
- La Vmax disminuye.
En el gráfico de Lineweaver-Burk, las rectas con y sin inhibidor parten de un mismo punto en el eje de abscisas (un valor común de −1/Km), pero la recta con el inhibidor corta el eje de ordenadas más arriba (un valor mayor de 1/Vmax).
Análisis de un problema tipo
Si en el gráfico de Lineweaver-Burk se presentan tres rectas, la identificación se realiza mediante dos criterios: los puntos de intersección con los ejes.
- Dos rectas que se cruzan en el eje de ordenadas difieren en su valor de Km. La recta con mayor Km (cuyo punto −1/Km se encuentra más cerca del eje de ordenadas) corresponde al inhibidor competitivo; la otra, a la reacción sin inhibidor.
- La tercera recta, que parte del mismo punto en el eje de abscisas que la recta sin inhibidor, pero corta el eje de ordenadas más arriba, corresponde al inhibidor no competitivo.
Para calcular la Vmax a partir de la intersección con el eje de ordenadas, se utiliza la relación recíproca: si 1/Vmax = 0,3, entonces Vmax = 1/0,3 ≈ 3,33 (en las unidades de velocidad correspondientes).
Puntos clave
- La velocidad de una reacción enzimática se evalúa mediante el cambio en la concentración del sustrato o del producto.
- La Vmax se alcanza cuando los centros activos de la enzima están completamente saturados por el sustrato.
- La Km es la concentración de sustrato a ½ Vmax; una Km menor indica una mayor afinidad de la enzima por el sustrato.
- La hexocinasa posee una Km baja y actúa a cualquier concentración de glucosa; la glucocinasa, con una Km alta, se activa únicamente en condiciones de hiperglucemia.
- La ecuación de Michaelis-Menten describe la dependencia hiperbólica de V₀ respecto a [S].
- El gráfico de Lineweaver-Burk linealiza esta dependencia en coordenadas dobles recíprocas.
- El inhibidor competitivo aumenta la Km sin alterar la Vmax; las rectas se cruzan en el eje 1/V₀.
- El inhibidor no competitivo disminuye la Vmax sin alterar la Km; las rectas parten de un punto común en el eje 1/[S].