Protein-Chromatographie

Gelfiltration: Trennung nach molekularer Masse

Diese Methode basiert auf dem Molekularsiebeffekt. Das Wesen des Prozesses besteht darin, Proteinmoleküle durch einen spezialisierten Träger — geschwollene Sephadex-Granula — zu sieben.

Sephadex selbst stellt eine komplexe räumliche Struktur dar. Es handelt sich um dreidimensionale Polysaccharidketten aus Dextran, in deren Inneren Poren mit einem bestimmten Durchmesser ausgebildet sind. Beim Durchleiten des Gemischs durch die Säule hängt die Vorschubgeschwindigkeit verschiedener Proteine direkt von ihrer molekularen Masse ab.

Die Trennung erfolgt nach folgendem Prinzip:

• Moleküle mit geringerer Masse dringen frei in den inneren Porenraum der Sephadex-Granula ein. Aus diesem Grund verlängert sich ihr Weg, sie werden in der Säule zurückgehalten und verlassen diese deutlich später.
• Moleküle mit hoher Masse hingegen sind physikalisch nicht in der Lage, in das Innere der Dextranporen zu gelangen. Sie umströmen die Granula von außen und eluieren (waschen sich) folglich schneller aus der chromatographischen Säule aus.

Ionenaustauschchromatographie: Die Rolle der elektrischen Ladung

Diese Art der Fraktionierung basiert auf elektrostatischen Wechselwirkungen. Der Prozess läuft über die Bindung ionisierter Gruppen der Proteine selbst an entgegengesetzt geladene funktionelle Gruppen des Trägers ab. Als solcher Träger fungieren Ionenaustauschharze — spezielle unlösliche Polymermaterialien.

Die Grundregel der Methode: Die Adsorptionsstärke (die Bindung des Proteins an das Harz) ist streng proportional zur Größe der elektrischen Ladung des Proteinmoleküls. Je stärker ein Protein geladen ist, desto fester wird es an das Polymer fixiert.

Um das isolierte Protein von der Säule zu lösen, wird das Verfahren der Elution (des Abspülens) angewendet. Die adsorbierten Proteine werden mithilfe von Natriumchloridlösungen (NaCl) ausgewaschen. Dabei wird die Salzkonzentration schrittweise erhöht. Die Gesetzmäßigkeit der Elution ist wie folgt: Je geringer die Ladung eines bestimmten Proteins ist, desto geringer ist die NaCl-Konzentration, die erforderlich ist, um seine Bindung an die ionogenen Gruppen des Harzes zu lösen und es in ein Reagenzglas auszuspülen.

Affinitätschromatographie: Absolute Spezifität

Unter allen betrachteten Ansätzen hebt sich die Affinitätschromatographie als spezifischste Methode zur Isolierung einzelner Proteine hervor. Sie ermöglicht es, das gewünschte Makromolekül gezielt aus komplexesten Gemischen „herauszufischen“.

Der Mechanismus dieser Methode umfasst mehrere aufeinanderfolgende Schritte:

1. Trägervorbereitung: An ein chemisch inertes Polymer wird über kovalente Bindung ein Ligand — ein Molekül, mit dem das Zielprotein unter natürlichen Bedingungen interagiert — fest gekoppelt.
2. Aufgabe des Gemischs: Die Proteinlösung wird auf die Säule aufgetragen. In diesem Moment erfolgt eine streng komplementäre Bindung des gewünschten Proteins an den immobilisierten Liganden.
3. Endergebnis: An der Polymersäule wird ausschließlich das Protein adsorbiert, das für diesen spezifischen Liganden spezifisch ist. Alle anderen (Ballast-)Proteine passieren die Säule ungehindert, ohne zurückgehalten zu werden.

Fragen aus Vorlesungen und Prüfungen

Was es zum Thema noch zu wiederholen gibt

• Dreidimensionale Struktur und Eigenschaften von Dextran-Polysaccharidketten.
• Chemische Beschaffenheit unlöslicher Ionenaustauschharze.
• Mechanismen der kovalenten Anbindung eines Liganden an ein inertes Polymer.
• Natur der komplementären Bindung von Protein und Ligand.

Weitere Themen des Kapitels „Struktur, Eigenschaften und Funktionen von Proteinen“

Das Material wurde von Dozenten von WhiteCoat Pro nach dem Lehrplan medizinischer Hochschulen erstellt. Es hat Bildungscharakter.