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简而言之。 革兰染色法（1884年，汉斯·克里斯蒂安·革兰）是细菌分类的基本方法：革兰阳性菌（G+）被染成紫色（富含肽聚糖的厚细胞壁能锁住结晶紫-碘复合物），革兰阴性菌（G−）被染成粉红色（薄肽聚糖层 + 含脂多糖的外膜，复合物会被酒精洗脱，随后用番红/复红复染）。3–5分钟内即可提供初步方向：革兰阳性球菌 — 葡萄球菌/链球菌/肠球菌；革兰阴性杆菌 — 肠杆菌科、假单胞菌；革兰阳性杆菌 — 梭菌、单核细胞增生李斯特菌、芽孢杆菌；革兰阴性球菌 — 奈瑟菌属。对于在培养结果出来前选择经验性抗生素治疗至关重要。
1. 历史与作者
- 由丹麦微生物学家汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年研发。
- 最初用于在肺部涂片中鉴别肺炎链球菌与克雷伯菌。
- 自20世纪20年代起成为医学微生物学的标准方法。
- 基于细胞壁结构的差异。
2. 操作方法（4个步骤）
| 分期 | 试剂 | 时间 | 结果 |
|---|---|---|---|
| 1. 初染 | 结晶紫 / 龙胆紫 | 1分钟 | 所有细胞呈紫色 |
| 2.媒染 | 卢戈氏碘液 (I₂-KI) | 1分钟 | 形成结晶紫-碘复合物 |
| 3. 脱色 | 95%–96% 乙醇或丙酮 | 15–30秒 | 革兰阴性菌失去染料；革兰阳性菌保留染料 |
| 4. 复染 | 番红或派弗尔复红 | 1分钟 | 革兰阴性菌呈粉红色；革兰阳性菌保持紫色 |
- 各步骤之间需用蒸馏水冲洗。
- 关键点：脱色时间过长会导致假阴性（革兰阳性菌变为粉红色）。
- 标本来源 — 原生标本（痰液、尿液、脑脊液、伤口分泌物）或培养基上的菌落。
3. 细胞壁结构
革兰阳性菌
- 厚层肽聚糖（20–80 nm）。
- 含有磷壁酸和脂磷壁酸。
- 无外膜。
- 肽聚糖-碘-结晶紫复合物分子较大，不易被酒精洗脱。
- 对青霉素类、万古霉素、溶菌酶敏感。
革兰阴性菌
- 薄层肽聚糖（2–7 nm）。
- 含有脂多糖（LPS，即内毒素）和孔蛋白的外膜。
- 两层膜之间为周质空间。
- 经酒精处理后脂质层溶解 → 复合物被洗脱。
- 对万古霉素耐药（无法穿透外膜）。
4. 革兰阳性菌 — 最重要代表
| 菌属 | 类型 | 病型 | 疾病 |
|---|---|---|---|
| Staphylococcus | S. aureus | 葡萄串状球菌 | 脓皮病、脓毒症、心内膜炎、肺炎 |
| Streptococcus | S. pyogenes (BGA) | 链状球菌 | 咽峡炎、猩红热、丹毒、急性肾小球肾炎 |
| Streptococcus | S. pneumoniae | 矛头状双球菌 | 肺炎、脑膜炎、中耳炎 |
| Enterococcus | E. faecalis | 双球菌 | 尿路感染 (UTI)、心内膜炎 |
| Bacillus | B. anthracis | 杆菌 | 炭疽 |
| Clostridium | C. difficile, tetani, botulinum, perfringens | 厌氧杆菌 | 伪膜性结肠炎、破伤风、肉毒中毒、气性坏疽 |
| Listeria | L. monocytogenes | 杆菌 | 孕妇及新生儿李斯特菌病 |
| Corynebacterium | C. diphtheriae | 杆菌 | 白喉 |
5. G阴性杆菌——最重要的
| 菌属 | 代表菌群 | 疾病 |
|---|---|---|
| Enterobacteriaceae | E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia | 尿路感染、脓毒症、肺炎、腹膜炎 |
| Salmonella | S. typhi, S. enteritidis | 伤寒、沙门菌病 |
| Shigella | 痢疾志贺菌等 | 志贺菌病 |
| Pseudomonas | P. aeruginosa | 医院获得性感染、呼吸机相关性肺炎（VAP）、烧口创面感染 |
| Acinetobacter | A. baumannii | 医院获得性感染、多重耐药（MDR） |
| Neisseria | N. meningitidis, N. gonorrhoeae | 脑膜炎、淋病 |
| Haemophilus | H. influenzae | 会厌炎、脑膜炎、中耳炎 |
| Bordetella | B. pertussis | 百日咳 |
| Campylobacter | C. jejuni | 肠炎 |
| Helicobacter | H. pylori | 胃炎、消化性溃疡、胃癌 |
6. “革兰染色不着色”
- 分枝杆菌（结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌）——含蜡质细胞壁；抗酸染色（Ziehl-Neelsen染色，AFB）。
- 支原体（肺炎支原体）——无细胞壁；革兰染色不可见。
- 螺旋体（梅毒螺旋体、疏螺旋体属）——纤细、着色差；暗视野显微镜检查、镀银染色。
- 衣原体、立克次体——细胞内寄生菌。
- 军团菌——需镀银染色或使用特殊培养基（BCYE）。
7. 临床应用
- 痰液——社区获得性和医院获得性肺炎的快速初步评估。
- 脑脊液——脑膜炎紧急筛查：革兰阳性双球菌——肺炎链球菌；革兰阴性双球菌——脑膜炎奈瑟菌；革兰阴性杆菌——流感嗜血杆菌。
- 尿液——用于尿脓毒症；革兰阴性杆菌——多见肠杆菌科。
- 血液（血培养瓶标本）——用于脓毒症。
- 创面渗出物、脓液。
- 尿道/宫颈拭子——淋病（中性粒细胞内革兰阴性双球菌）。
8. 经验性抗生素治疗
- 社区获得性肺炎痰涂片见革兰阳性球菌——头孢曲松 ± 大环内酯类；高度怀疑肺炎链球菌。
- 尿液中见革兰阴性杆菌——头孢曲松、氟喹诺酮类。
- 脑脊液中见革兰阳性双球菌——头孢曲松 + 万古霉素（肺炎链球菌，警惕耐药性）。
- 脑脊液中见革兰阴性双球菌——头孢曲松（脑膜炎奈瑟菌）；密切接触者需隔离预防。
- 腹腔渗出液中见混合菌群——β-内酰胺类 + 抗厌氧菌药（甲硝唑）或碳青霉烯类。
- 产芽孢的革兰阳性厌氧杆菌——高度怀疑梭菌感染。
9. 方法学局限性
- 敏感性约 60%~80%（要获得可靠结果，视野中需 $\ge 10^5$ 个细菌）。
- 标本质量：痰液标本——依据质量标准质控（低倍镜下视野鳞状上皮细胞 $< 10$ 个且中性粒细胞 $> 25$ 个）。
- 无法区分活细胞与死细胞。
- 无法提供种属诊断（需结合培养 + 生化鉴定 + MALDI-TOF 质谱）。
- 不能替代药敏试验——抗生素敏感性仅能通过培养后测定。
10. 常见操作错误
- 脱色时间过长——假阴性（革兰阳性菌呈革兰阴性表现）。
- 脱色时间不足——假阳性。
- 陈旧菌株——革兰阳性菌可呈现革兰染色不定（多因细胞壁变薄所致）。
- 涂片过厚——脱色不彻底。
- 标本污染——可见多种形态型。
11. 现代替代与补充方法
- 培养联合 MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）鉴定——15分钟内出种属诊断。
- PCR 面板（Septi-Fast、FilmArray BCID/GI/RP）——快速检测血液、脑脊液、呼吸道标本中的病原体。
- 16S rRNA 测序——用于培养阴性时的病原体鉴定。
- 抗原检测（尿中肺炎球菌抗原、军团菌抗原检测）。
- 革兰染色因其快速和价廉仍作为首选筛查手段。
12. FAQ
为什么分枝杆菌革兰染色不着色？
其细胞壁含有高分子量的分枝菌酸和蜡质 $\to$ 疏水性表面阻止水溶性染料进入。需采用抗酸染色（齐-尼染色、金胺荧光染色）。
什么是革兰染色不定菌？
在不同条件下呈现不同染色结果的细菌：陈旧的革兰阳性菌（细胞壁变薄）、部分梭菌、李斯特菌。通常其本质仍为革兰阳性菌。
为什么尿液中的革兰阴性杆菌最常是大肠埃希菌？
大肠埃希菌是胃肠道的正常共生菌，也是社区获得性尿路感染的主要病因（70%~80%）。这是尿液中出现革兰阴性杆菌时的首要推测。
能否通过革兰染色区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌？
不能。两者均为成簇排列的革兰阳性球菌。需通过凝固酶试验（金黄色葡萄球菌阳性）、过氧化氢酶试验（两者均为阳性）及生化反应进行区分。
为什么万古霉素对革兰阴性菌无效？
万古霉素是大分子物质，可与肽聚糖中的 D-Ala-D-Ala 结合。革兰阴性菌外侧有外膜和微小的孔蛋白，万古霉素无法穿透。
参见： 抗生素 · 脓毒症 · 脑膜炎 · 结核病 · 微生物学目录
本材料仅供教育参考，不能替代医生诊断。治疗方案及剂量请参考现行临床指南。