Engenharia genética

Métodos de obtenção do material genético

O primeiro passo na criação de moléculas recombinantes é o isolamento ou a síntese artificial do gene-alvo. Para isso, a engenharia genética emprega várias abordagens principais:

• Isolamento de genes naturais. As estruturas genéticas (cromossomos ou plasmídeos) são isoladas por inteiro. Para a extração precisa da região desejada, utiliza-se a clivagem enzimática por meio de restritases — enzimas de restrição que cortano o DNA em ligações estritamente definidas. Se o objeto de estudo for o RNA, empregam-se ribozimas (enzimas com ação análoga à das restritases).
• Síntese química. Adequada para a criação de genes relativamente pequenos. O processo inclui três etapas: análise da proteína com determinação da sequência de aminoácidos $\rightarrow$ conversão da sequência de aminoácidos em nucleotídica (com base nos códons) $\rightarrow$ síntese direta do gene em um aparelho especial (sintetizador).
• Transcrição reversa. Utilizada no trabalho com vírus de RNA. Por meio da enzima reverterase (transcriptase reversa), a informação genética é copiada do RNA viral para o DNA.

Construção do vetor e do sistema de expressão

Após obter o gene-alvo, é necessário inseri-lo em um sistema de transporte — o vetor. A junção do gene desejado com o DNA vetorial é realizada por enzimas ligases (processo de ligação). Como vetores, utilizam-se habitualmente plasmídeos, bacteriófagos, bem como vírus humanos, animais ou vegetais.

Em seguida, a molécula de DNA recombinante é introduzida na célula receptora (célula hospedeira). A essência do processo é que, após a inserção do gene híbrido, a célula adquire uma nova propriedade e passa a sintetizar uma substância que não lhe era característica.

Organismos receptores:

1. Bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis, pseudomonas).
2. Leveduras.
3. Vírus.

Ao selecionar o receptor, consideram-se sua capacidade de incorporar o gene estranho, o nível de expressão (quão acentuada será a síntese), a segurança ambiental, a facilidade de cultivo em massa e a capacidade de secreção do produto para o exterior (no meio de cultura).

Problemas de produção e proteínas quiméricas

Na etapa de obtenção da substância desejada em escala, a produção biotecnológica depara-se com uma série de desafios. Os cientistas criam linhagens superprodutoras, capazes de reestruturar o metabolismo de modo que até metade da proteína produzida seja o produto estranho de interesse.

Contudo, a alta expressão não resolve todos os problemas. Se a célula não segrega o produto para o meio, sua extração exige a destruição (desintegração) da própria célula. Além disso, existe o risco quanto à integridade do produto: a proteína-alvo pode ser degradada por proteases intracelulares ou inibidores ainda durante o processo de síntese.

Para facilitar o reconhecimento e a recuperação da substância, emprega-se a técnica de criação de proteínas quiméricas. Um gene repórter (por exemplo, o gene da $\beta$-galactosidase ou o gene do interferon) é previamente acoplado ao gene da proteína desejada. Como resultado, a célula sintetiza uma única proteína híbrida, que é facilmente detectada. Após o isolamento, a porção marcadora é clivada, obtendo-se o produto-alvo puro.

Aplicação prática e barreiras de implantação

A engenharia genética e de proteínas permite solucionar uma ampla gama de problemas médicos, incluindo a terapia de patologias genéticas congênitas e a influência direcionada sobre o genoma. Centenas de medicamentos já foram criados por métodos de engenharia genética:

• Vacinas: contra a hepatite B.
• Hormônios: insulina, hormônios de crescimento, eritropoietina.
• Imunobiológicos: interferons, interleucinas, fator de necrose tumoral (TNF), mielopeptídeos, peptídeos tímicos, anticorpos monoclonais.
• Medicamentos para o sistema hemostático: ativador tisular do plasminogênio, fatores de coagulação sanguínea.
• Diagnósticos: antígenos do HIV.

No futuro próximo, espera-se o surgimento de vacinas recombinantes contra malária, sífilis, encefalite transmitida por carrapatos, raiva, bem como novos fatores estimuladores de colônias e neuropeptídeos.

Obstáculos à implantação (todos superáveis):

• Questões de segurança: preocupações devido ao risco de disseminação de microrganismos recombinantes (atualmente, a biossegurança está comprovada desde que sejam respeitadas as normas de trabalho).
• Complexidade tecnológica (processamento): necessidade de desenvolver esquemas complexos de purificação em várias etapas para separar a proteína-alvo da cultura produtora.
• Problema de identidade (bioequivalência): necessidade de evidências rigorosas de que a proteína artificial é completamente idêntica ao análogo natural, inclusive no dobramento correto da molécula.

Resumo: perguntas e respostas sobre o tema

Questões de aulas e exames

O que mais estudar sobre o tema

• Mecanismo de ação das enzimas de restrição e das DNA ligases
• Esquemas de desintegração de células bacterianas para isolamento de produtos
• Diferenças entre sistemas de liberação (vetores) plasmídicos e virais
• Desenvolvimentos promissores de vacinas recombinantes (HIV, malária, sífilis)

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