Essência e princípios da histoquímica
A análise histoquímica baseia-se no fato de que um reagente químico se liga a uma substância estritamente definida na célula ou na matriz extracelular. O produto da reação resultante destaca-se visualmente do restante das estruturas, uma vez que sua cor difere acentuadamente da tonalidade do reagente original. Assim, é possível determinar de forma confiável a composição bioquímica e a localização da substância.
Uma exceção à regra da reação química obrigatória são os corantes indiferentes, cuja ação é baseada na simples adsorção física ou na dissolução física do corante no substrato tecidual.
Métodos para detecção de ácidos nucleicos
Para a visualização separada de RNA e DNA, a histologia utiliza abordagens diferenciadas que produzem quadros de cores opostas nas lâminas.
- Detecção de RNA (Reação de Brachet). O preparo é tratado com uma mistura de verde de metila e pironina. As estruturas contendo RNA (ribossomos, nucléolos) coram-se de vermelho-framboesa com a pironina, enquanto os demais componentes tornam-se verdes. Um exemplo clássico é o tecido do pâncreas: as células secretoras sintetizam proteínas ativamente, são ricas em ribossomos, portanto seu citoplasma e nucléolos parecem avermelhados. Para controlar a especificidade, o corte é tratado com a enzima ribonuclease. Ela destrói o RNA, e a coloração avermelhada desaparece, provando que era especificamente o RNA que estava sendo corado.
- Detecção de DNA (Reação de Feulgen). Utiliza-se o ácido periódico de Schiff (reagente de Schiff ou ácido fucsina-sulfuroso). Nesse caso, a cromatina do núcleo, contendo DNA, adquire uma cor cereja ou roxa. Os nucléolos e o citoplasma são contracurados em verde. O exemplo das células hepáticas mostra claramente que a distribuição da coloração é absolutamente oposta aos resultados da reação de Brachet.
Detecção de carboidratos e glicosaminoglicanos
Polissacarídeos (glicogênio, glicoproteínas) e componentes do muco são detectados por meio da reação PAS (PAS-reaction). O nome do método refere-se à ação do ácido periódico e do reagente de Schiff (oxidação com ácido periódico seguida pela adição do reagente de Schiff). As estruturas PAS-positivas adquirem coloração roxa ou vermelho-escuro. Por exemplo, em uma lâmina de intestino delgado, o muco no citoplasma das células caliciformes do epitélio das vilosidades cora-se em um tom roxo brilhante.
Para detectar glicosaminoglicanos (GAGs) — componentes da substância amorfa do tecido conjuntivo — utiliza-se o corante básico azul de toluidina. Ele demonstra o fenômeno da metacromasia: a capacidade de mudar sua cor azul original para vermelho ou roxo ao se ligar ao tecido. A base química desse fenômeno reside na interação do corante com heteropolissacarídeos contendo um grande número de grupos ácidos (radicais). Um exemplo claro de metacromasia pode ser observado em um preparado da parede da aorta.
Reações para proteínas e gorduras neutras
Para detectar estruturas proteicas (grupos de aminoácidos), utilizam-se reagentes específicos:
- Com azul de bromofenol: as proteínas coram-se em roxo-escuro.
- Reagente ninidrina-Schiff: confere às proteínas um tom avermelhado.
Gorduras neutras e lipídios são detectados com o corante Sudão III. Ele pertence ao grupo dos corantes lipofílicos indiferentes. O Sudão III não participa de uma reação química, mas atua por meio de dissolução física no substrato. Ele penetra na célula e se dissolve nas gotímidas de lipídios (de forma análoga à ação do ácido ósmico), conferindo às inclusões de gordura uma cor laranja viva. Um excelente exemplo é a preparação de lâmina total de omento (onde o fragmento de tecido é simplesmente estendido sobre a lâmina de vidro), na qual as células de gordura — os adipócitos — são claramente visíveis com grandes gotículas de gordura alaranjadas.
Resumo: perguntas e respostas sobre o tema
Quais estruturas se coram em verde na reação de Brachet e por quê?
Na reação de Brachet, a cor verde é dada pelas estruturas nucleares contendo DNA e pelas demais estruturas, enquanto as estruturas contendo RNA coram-se de vermelho-framboesa. O reagente é uma mistura de verde de metila e pironina: os ribossomos e nucléolos coram-se de vermelho-framboesa com a pironina; os núcleos (DNA) são descritos nas fontes como verdes.
Quais outros corantes indiferentes, além do Sudão III, são utilizados para detectar lipídios?
Além do Sudão III, as fontes listam para a detecção de gorduras/lipídios:
- Sudão IV — cora as gorduras de vermelho.
- Sudão negro B — cora as gorduras de preto.
Para os corantes do grupo Sudão, o mecanismo é indicado: eles são indiferentes, lipofílicos, não participam de reação química e dissolvem-se fisicamente nas gotículas de gordura e lipídios.
Também são indicados como agentes especiais para a detecção de gorduras: o Vermelho Oleoso O e o Vermelho Escarlate — cor vermelha; ácido ósmico — cor preta; azul do Nilo sulfato — ácidos graxos em azul-escuro, gorduras neutras em vermelho.
Brachet — RNA — vermelho-framboesa (via pironina). Feulgen — DNA — cereja (via reagente de Schiff).
Questões de aulas e exames
Qual é a principal diferença entre o método histoquímica e a coloração convencional?
A base da histoquímica é uma reação química específica entre o reagente e uma substância específica da célula, e não a simples deposição do corante.
Por que a ribonuclease é utilizada na reação de Brachet?
A ribonuclease serve para o controle de especificidade: a enzima destrói o RNA, após o qual a cor desaparece. Isso prova que foi especificamente o RNA que se corou de vermelho-framboesa.
O que é metacromasia usando o azul de toluidina como exemplo?
É a capacidade do corante de mudar sua cor de azul para roxo ou vermelho ao se ligar aos grupos ácidos dos glicosaminoglicanos.
O Sudão III participa de uma reação química com as gorduras?
Não, ele é um corante lipofílico indiferente. Ele se dissolve fisicamente nas gotículas de gordura, conferindo-lhes uma cor laranja.
O que mais estudar sobre o tema
- O mecanismo de oxidação de polissacarídeos por ácido periódico na reação de PAS
- Propriedades e tipos do reagente de Schiff (ácido fucsina-sulfuroso)
- Preparados de tela inteira (total mounts): diferenças em relação aos cortes de micrótomo
- Localização de glicosaminoglicanos na parede dos vasos
Estude o tema completo no curso de «Histologia»
Aqui está um resumo. No curso, você encontra tudo o que é cobrado em aula e na prova.
- O guia metodológico completo sobre o tema «Métodos de pesquisa histoquímica» e outras 3.485 páginas da disciplina
- Exercícios e testes após cada tópico — como no colóquio
- Tutor de IA responderá a perguntas sobre o tópico a qualquer momento
- 137 vídeo-aulas da disciplina
Outros tópicos da seção «Técnica de pesquisa histológica»
Videoaulas gratuitas: histologiaAulas curtas com resumos — sem necessidade de cadastro.
Material preparado por professores da WhiteCoat Pro de acordo com o currículo de medicina. Possui caráter educacional.