Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA): prinsip metode

Prinsip umum dan mekanisme reaksi

Dalam enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), peran kunci dimainkan oleh konjugat — antibodi yang secara kimiawi dilekati oleh enzim. Sebagian besar label yang digunakan adalah horseradish peroxidase (HRP), $\beta$-galactosidase, atau alkaline phosphatase.

Reaksi berlangsung dalam beberapa tahap:

Pembentukan kompleks imun «antigen-antibodi».
Penambahan substrat atau kromogen khusus.
Enzim yang berada di dalam konjugat memecah substrat.
Hasil pemecahan tersebut mengubah warna larutan.

Intensitas warna yang muncul berbanding lurus dengan jumlah molekul yang berikatan. Hal ini memungkinkan kuantifikasi zat yang dianalisis. Untuk menghentikan reaksi pada waktu yang tepat, asam ditambahkan ke dalam campuran untuk mendenaturasi enzim.

Video pembelajaran gratisVirus Imunodefisiensi Manusia: struktur, siklus hidup, dan diagnosis

ELISA fase padat

Metode yang paling banyak digunakan adalah ELISA fase padat (ELISA). Fitur utamanya adalah salah satu komponen (antigen atau antibodi) telah dilekatkan (disorpsi) terlebih dahulu pada penunjang padat. Biasanya, sumur pelat polistirena bertindak sebagai penunjang tersebut.

Kondisi paling penting untuk keberhasilan ELISA fase padat adalah pencucian sumur pelat secara menyeluruh setelah setiap penambahan reagen baru. Hal ini diperlukan untuk menghilangkan semua molekul yang tidak terikat secara sempurna guna mencegah hasil positif palsu.

Uji diri Anda pada topik iniTugas dari bank soal kursus «Mikrobiologi» — jawaban dan pembahasan langsung.

Varian utama ELISA

Tergantung pada tujuan diagnostik, berbagai skema analisis digunakan:

Deteksi antibodi (serodiagnosis): Tujuannya adalah untuk menemukan imunoglobulin spesifik terhadap patogen dalam serum pasien. Antigen yang diketahui difiksasi di dasar sumur. Ketika serum pasien ditambahkan, antibodinya (jika ada) akan berikatan dengan antigen. Kemudian, konjugat (serum anti-globulin dengan enzim) ditambahkan, yang menempel pada fragmen Fc antibodi pasien. Penambahan substrat menyebabkan perubahan warna.
Deteksi antigen («metode sandwich»): Digunakan untuk mencari patogen itu sendiri atau bagian-bagiannya. Antibodi diagnostik diimobilisasi di dalam sumur. Antibodi ini «menangkap» antigen target dari serum pasien. Setelah itu, antibodi berlabel terhadap antigen yang sama dimasukkan, melengkapi kompleks («sandwich»). Adanya enzim dikonfirmasi oleh reaksi warna.
ELISA kompetitif: Metode ini didasarkan pada persaingan molekul untuk memperebutkan jumlah tempat ikatan yang terbatas. Misalnya, saat mencari antigen, antigen target pasien dan antigen standar berlabel yang ditambahkan bersaing untuk berikatan dengan antibodi.

Penerapan dalam praktik klinis

Berkat sensitivitasnya yang sangat tinggi (mendeteksi konsentrasi hingga $10^{-10}$ — $10^{-12}$ g/L), ELISA banyak digunakan dalam kedokteran modern.

Bidang penggunaan utama:

Diagnosis penyakit infeksi: virus (termasuk hepatitis B dan HIV), bakteri, parasit.
Penentuan kuantitatif molekul aktif secara biologis seperti hormon dan enzim.
Pemantauan konsentrasi obat di dalam tubuh.

Singkatnya: jawaban atas pertanyaan topik

Kelas antibodi (imunoglobulin) apa yang ditentukan secara diferensial dengan metode ELISA untuk menilai stadium proses infeksi?

Metode ELISA menentukan imunoglobulin kelas M dan G secara diferensial.

Imunoglobulin kelas M (IgM) — penanda infeksi baru; pada infeksi virus herpes, peningkatan titer IgM sebesar 4 kali lipat atau lebih mengindikasikan infeksi primer.
Imunoglobulin kelas G (IgG) — pada infeksi virus herpes, peningkatan titer mengindikasikan bentuk penyakit yang berulang; pada infeksi rotavirus, kekebalan pascainfeksi dimediasi oleh antibodi kelas IgG.

Cara menghafal

Untuk mengingat esensi metode sandwich, bayangkan sebuah roti lapis (sandwich): bagian bawah roti adalah antibodi terimobilisasi di dasar sumur, isian (daging) adalah antigen target dari darah pasien, dan bagian atas roti adalah antibodi berlabel yang ditambahkan untuk menutup susunan tersebut.

Soal-soal dari kelas dan ujian

Apa itu konjugat dalam ELISA?

Konjugat adalah antibodi yang terikat kuat (terkonjugasi) dengan molekul enzim, yang berfungsi sebagai label untuk visualisasi reaksi selanjutnya.

Apa perbedaan antara metode deteksi langsung dan tidak langsung?

Skema pencarian antibodi dalam serum (serodiagnosis) adalah metode tidak langsung karena label enzim terletak pada antibodi sekunder (antiglobulin), sedangkan metode sandwich ditujukan untuk mencari antigen.

Ada yang kurang jelas? Tanyakan pada AIAI-tutor telah membaca materi tentang «Enzim-linked immunosorbent assay» dan akan menjelaskannya dengan kata-kata yang sederhana.

Topik lain untuk dipelajari

Mekanisme kerja terperinci dari horseradish peroxidase
Penyebab hasil positif palsu dan negatif palsu pada ELISA
Spektrofotometri: bagaimana instrumen membaca intensitas warna
Fitur ELISA dalam diagnosis infeksi HIV
Perbandingan ELISA dengan diagnosis PCR

Pelajari topik ini secara lengkap dalam kursus "Mikrobiologi"

Di sini adalah ringkasan. Di dalam kursus — semua yang ditanyakan saat kelas dan ujian.

Panduan praktis lengkap tentang «Enzim-linked immunosorbent assay» dan 4.383 halaman materi mata kuliah lainnya
Tugas dan kuis setelah setiap topik — seperti pada kolokium
AI-tutor akan menjawab pertanyaan topik kapan saja
141 video pembelajaran untuk mata kuliah ini

Buka pembahasan lengkap Silabus mata kuliahmulai dari 599 ₽ per bulan