Allgemeines Prinzip und Reaktionsmechanismus
Beim Enzymimmunoassay (ELISA) spielt das Konjugat eine Schlüsselrolle — Antikörper, an die chemisch ein Enzym gebunden ist. Am häufigsten werden Meerrettichperoxidase, $\beta$-Galactosidase oder alkalische Phosphatase als Marker verwendet.
Die Reaktion verläuft in mehreren Schritten:
- Bildung des Antigen-Antikörper-Immunkomplexes.
- Zugabe eines speziellen Substrats oder Chromogens.
- Das im Konjugat enthaltene Enzym spaltet das Substrat.
- Durch die Spaltung verändert sich die Farbe der Lösung.
Die Intensität der entstandenen Färbung hängt direkt von der Anzahl der gebundenen Moleküle ab. Dies ermöglicht eine quantitative Bewertung der analysierten Substanz. Um die Reaktion im gewünschten Moment zu stoppen, wird der Mischung Säure zugegeben, die das Enzym denaturiert.
Heterogener Enzymimmunoassay (ELISA)
Am weitesten verbreitet ist der heterogene Enzymimmunoassay (ELISA). Dessen Hauptmerkmal ist, dass eine der Komponenten (Antigen oder Antikörper) im Voraus auf einem festen Träger fixiert (sorbiert) ist. Die Rolle des Trägers übernehmen üblicherweise die Vertiefungen von Polystyrolplatten.
Eine entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung des ELISA ist das gründliche Waschen der Vertiefungen der Platte nach jeder Zugabe eines neuen Reagenzes. Dies ist notwendig, um alle ungebundenen Moleküle vollständig zu entfernen und das Auftreten falsch-positiver Ergebnisse zu verhindern.
Hauptvarianten des ELISA
Je nach Diagnoseziel werden verschiedene Testschemata angewendet:
- Antikörpernachweis (Serodiagnostik): Das Ziel ist es, spezifische Immunglobuline gegen den Erreger im Serum des Patienten zu finden. Am Boden der Vertiefung wird ein bekanntes Antigen fixiert. Bei Zugabe des Patientenserums binden sich dessen Antikörper (sofern vorhanden) an das Antigen. Dann wird das Konjugat (Antiglobulinserum mit Enzym) zugegeben, welches an die Fc-Fragmente der Patientenantikörper bindet. Die Zugabe des Substrats führt zu einer Färbung.
- Antigennachweis („Sandwich-Methode“): Wird zum Nachweis des Erregers selbst oder von Erregerbestandteilen verwendet. In der Vertiefung sind diagnostische Antikörper fixiert. Diese „fangen“ das gesuchte Antigen aus dem Patientenserum ab. Danach werden markierte Antikörper gegen dasselbe Antigen hinzugefügt, die den Komplex vervollständigen („Sandwich“). Das Vorhandensein des Enzyms wird durch eine Farbreaktion bestätigt.
- Konkurrierender ELISA: Die Methode basiert auf dem Wettbewerb von Molekülen um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen. Beispielsweise konkurrieren beim Nachweis eines Antigens das gesuchte Antigen des Patienten und ein hinzugefügtes markiertes Standard-Antigen um die Bindung an Antikörper.
Anwendung in der klinischen Praxis
Dank seiner extrem hohen Empfindlichkeit (Nachweis von Konzentrationen bis zu $10^{-10}$ — $10^{-12}$ g/l) wird der ELISA in der modernen Medizin breit angewendet.
Hauptanwendungsbereiche:
- Diagnostik von Infektionskrankheiten: viralen (einschließlich Hepatitis B und HIV), bakteriellen, parasitären Ursprungs.
- Quantitative Bestimmung biologisch aktiver Moleküle wie Hormone und Enzyme.
- Überwachung der Konzentration von Medikamenten im Körper.
Kurz gefasst: Antworten auf Fragen zum Thema
Welche Immunglobulinklassen werden mittels ELISA differenziert bestimmt, um das Stadium des Infektionsprozesses zu beurteilen?
Mittels ELISA werden Immunglobuline der Klassen M und G differenziert bestimmt.
- Immunglobuline der Klasse M (IgM) — Marker einer frischen Infektion; bei einer Herpesvirusinfektion weist ein Anstieg des IgM-Titers um das 4-fache oder mehr auf eine Primärinfektion hin.
- Immunglobuline der Klasse G (IgG) — bei einer Herpesvirusinfektion spricht ein Titeranstieg für eine rezidivierende Form der Erkrankung; bei einer Rotavirusinfektion wird die Immunität nach der Infektion durch Antikörper der Klasse IgG vermittelt.
Um sich das Wesen der Sandwich-Methode zu merken, stellen Sie sich ein Sandwich vor: Die untere Brotscheibe sind die fixierten Antikörper am Boden der Vertiefung, der Belag (Fleisch) ist das gesuchte Antigen aus dem Blut des Patienten, und die obere Brotscheibe sind die hinzugefügten markierten Antikörper, welche die Konstruktion abschließen.
Fragen aus Vorlesungen und Prüfungen
Was ist ein Konjugat beim ELISA?
Ein Konjugat sind Antikörper, die fest an ein Enzymmolekül gebunden (konjugiert) sind, das als Marker für die nachfolgende Visualisierung der Reaktion dient.
Worin liegt der Unterschied zwischen direkter und indirekter Nachweismethode?
Das Schema mit der Suche nach Antikörpern im Serum (Serodiagnostik) ist eine indirekte Methode, da sich die Enzymmarkierung an den sekundären (Antiglobulin-)Antikörpern befindet, während die Sandwich-Methode auf die Suche nach Antigenen ausgerichtet ist.
Was es zum Thema noch zu wiederholen gibt
- Ausführlicher Mechanismus der Meerrettichperoxidase
- Ursachen für falsch-positive und falsch-negative ELISA-Ergebnisse
- Spektralphotometrie: Wie Geräte die Farbintensität messen
- Besonderheiten des ELISA bei der Diagnostik einer HIV-Infektion
- Vergleich von ELISA und PCR-Diagnostik
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